說(shuō)起提取質(zhì)粒，想必是做分子生物學(xué)的搬磚工們每天的常規(guī)工作,。隨著各大公司開(kāi)發(fā)出各種質(zhì)粒提取 kit,，為苦逼的生物狗帶來(lái)了福音—試劑再也不用自己配了，提取步驟再也不用那么繁瑣了,。

但，你先別著急高興,，久而久之,，很多剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小白師弟師妹再也不懂得背后的原理：質(zhì)粒提取出來(lái)?yè)诫s有蛋白或者基因組 DNA 怎么辦？待轉(zhuǎn)染或酶切的質(zhì)粒被有機(jī)溶劑污染了怎么辦,？且聽(tīng)我一一道來(lái),。

質(zhì)粒是獨(dú)立于基因組外的小型環(huán)狀 DNA 分子，能夠自我復(fù)制,，在分子克隆中是最常用的外源基因載體,。在自然狀態(tài)下，質(zhì)粒常存在于細(xì)菌中,，攜帶對(duì)宿主在某些特殊情況下的抗性基因,，例如抗生素抗性基因,。

舉個(gè)栗子，如圖所示,，這是質(zhì)粒 pBR322 的示意圖,，第一個(gè)被廣泛用作基因載體的質(zhì)粒。不僅能夠獨(dú)立自主復(fù)制（ori）,，而且在多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning sites）處可以插入想要表達(dá)的目的基因,，將插入目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)菌或真核細(xì)胞中，在合適的條件下目的基因便可得到表達(dá),。

為了方便驗(yàn)證轉(zhuǎn)化是否成功，質(zhì)粒上還帶有篩選標(biāo)記——抗性基因,，在質(zhì)粒 pBR322 中是 amp 和 tet 抗性,。在轉(zhuǎn)化后，向培養(yǎng)基中加入 amp 或 tet,，能夠生長(zhǎng)的菌株就是成功轉(zhuǎn)化的,。

說(shuō)了這么多,，我們?cè)趺吹玫竭@么好的質(zhì)粒呢？下面我想大家介紹一種最經(jīng)典,，也是最靈活的質(zhì)粒提取步驟和每個(gè)步驟的原理,。

細(xì)菌的培養(yǎng)

1. 從瓊脂 LB 平板上挑取單菌落，接種到液體 LB 培養(yǎng)基中,，過(guò)夜培養(yǎng),。

Tips：菌體里的質(zhì)粒一般含有抗生素抗性基因，在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中要向培養(yǎng)基中加入相對(duì)應(yīng)的抗生素,，以防質(zhì)粒丟失,。

細(xì)菌的收獲,，裂解

細(xì)菌的收獲一般通過(guò)離心進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解有多種方式,，包括離子型/非離子型去污劑,，有機(jī)溶劑,，或者堿裂解，加熱等,。選擇哪一種方式主要看質(zhì)粒的大小，大于 15kb 的大型質(zhì)粒要注意采用溫和的方法（溶菌酶法）,，劇烈的方法容易使它收到破壞,。

而小于 15kb 小型質(zhì)粒則可采取相對(duì)劇烈的方法（堿裂解法或煮沸法）。由于我們平時(shí) 大多質(zhì)粒都小于 15kb,，所以今天主要講最常用的堿裂解法小提質(zhì)粒,。

1. 將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌培養(yǎng)液倒入 1.5 ml 小離心管中,，在小離心機(jī)中 12 000 rpm，4 ℃ 離心 30 s,。

2. 盡可能倒干培養(yǎng)液上清,。

3. 將細(xì)菌沉淀，所得重懸于 100 μl 用冰預(yù)冷的溶液 I 中,，劇烈振蕩,。

Tips：這一步主要作用是重懸菌體,，EDTA 是金屬螯合劑，主要作用是防止下一步的裂解過(guò)程中內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割,。

4. 加入 200ul 新配置的溶液 II,，蓋緊管口,，快速顛倒離心管 5 次,，切勿震蕩，將離心管置于冰上,。

Tips：菌體在強(qiáng)堿性條件下裂解,，釋放出包括質(zhì)粒在內(nèi)的核酸,，蛋白等物質(zhì),。注意混勻要輕柔，否則基因組 DNA 裂解成小片段,，有可能對(duì)質(zhì)粒造成污染。SDS 作用是結(jié)合蛋白質(zhì),，為下一步做準(zhǔn)備,。

5. 加 150μl 用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ,，蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩 10 秒鐘,，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,，之后將管置于冰上 3-5 分鐘,。

Tips：這一步主要作用是中和,，避免質(zhì)粒長(zhǎng)時(shí)間在堿性條件下造成損傷，此時(shí)質(zhì)粒溶解在中和液上清中,。SDS 的鉀鹽是不溶于水的，也直接導(dǎo)致與之結(jié)合的蛋白質(zhì)沉淀,，由于基因組 DNA 很大,，而且與部分蛋白質(zhì)結(jié)合，也造成了共沉淀,。

6. 在小離心機(jī)中 12 000 rpm,，4 ℃，離心 5 min,，將上清轉(zhuǎn)移到新離心管中。

Tips：經(jīng)過(guò)離心,，不溶的大分子核酸,，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被沉淀下去，而可溶的質(zhì)粒在上清中,。

7. 加等體積得酚: 氯仿,，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于 4 ℃ 以 12 000 g 離心,，上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

Tips：雖然經(jīng)過(guò)沉淀可以去除大部分蛋白質(zhì),，但還是有部分蛋白殘留,，所以利用蛋白質(zhì)在酚中強(qiáng)烈變性，可以比較徹底的將蛋白質(zhì)抽提掉,。酚在水中微溶，所以加入氯仿,，以便使酚溶解在有機(jī)相中,。而且增加有機(jī)相的比重，離心后使水相和有機(jī)相更徹底的分開(kāi),。吸取上清時(shí),，會(huì)看到明顯的兩相分界線，分界線上會(huì)看到薄薄的一層白色,，這就是變性的蛋白質(zhì),，注意不要吸到上清中。如果用的是酚的水溶液抽提,，那么還要再加上一步氯仿抽提,，以除去殘留的酚,，否則會(huì)致使酶切,，PCR 等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

質(zhì)粒的回收

1. 用 2 倍體積的無(wú)水乙醇于室溫沉淀質(zhì)粒,。振蕩混合，于室溫放置 2 分鐘,。

Tips：乙醇沉淀 DNA 的優(yōu)點(diǎn)是,，它可以與水任意比例混溶，而且不與質(zhì)粒發(fā)生反應(yīng),，順便還可以溶解去除上一步的有機(jī)溶劑，在高濃度鹽的溶液中,，加入無(wú)水乙醇更容易讓質(zhì)粒沉淀,。

2. 在小離心機(jī)中 12 000 rpm，4 ℃,，離心 5 min，收集沉淀的質(zhì)粒,。

3. 小心倒去上清液，將離心管倒置在紙巾上,，排干殘留的無(wú)水乙醇,。

4. 加入 1 ml 的 70% 乙醇水溶液，蓋緊蓋管,，顛倒數(shù)次，在小離心機(jī)中 12 000 rpm,，4 ℃,，2 min,，回收質(zhì)粒,。

Tips：在質(zhì)粒提取過(guò)程中，溶液 I,，II,，Ⅲ中的鹽還殘留在離心管中,，這一步主要作用是溶解殘留的鹽,，質(zhì)粒沉淀在下面，達(dá)到提純的效果,。

5. 倒掉上清,，倒置在紙巾上，在空氣中將酒精溶液會(huì)發(fā)干凈,，直到試管中沒(méi)有可見(jiàn)液體,。

Tips：注意一定要將酒精溶液揮發(fā)干凈，否則同樣影響進(jìn)一步的酶切等反應(yīng),。這里有個(gè)小技巧送給大家，小編平時(shí)如果急用的話,，會(huì)把 EP 管放進(jìn)超凈臺(tái),，打開(kāi)通風(fēng)，這樣 15 min 左右就完全揮發(fā)干凈啦,。

6. 加入 50 ul 的去 RAN 酶和 DNA 酶的 TE 溶液震蕩重新溶解質(zhì)粒,，儲(chǔ)藏于 -20 ℃ 備用。

Tips：如果有滅菌的蒸餾水也是可以的,。