|
背景 Cre/LoxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體,，是非常經(jīng)典有效的基因編輯技術,。 1. 什么是Cre Cre重組酶(cyclizationrecombination)，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白,，可以引發(fā)loxP位點的DNA 重組,。 Cre就是一個重組酶，可以識別LoxP位點,。 https://www./cre-lox/ addgene上的介紹 （1）如果loxP位點位于相同的DNA鏈上,，并且方向相反，那么重組就會導致反轉,，并且loxP位點之間的DNA區(qū)域是反向的,。 （2）如果這些位點面向同一方向，則loxP位點之間的序列作為一段環(huán)狀DNA被切除(并且不被保留),。 （3）如果這些位點位于不同的DNA鏈上,，loxP位點就會產(chǎn)生一個易位事件。  image.png 首先我們需要將Cre載入到細胞中,，此時已經(jīng)有成熟的試劑盒可以做到。 通過CRISPR-Cas9系統(tǒng),，可以將CreER插入到AAVS1（腺樣病毒相關位點1）,，藉由AAVS1安全港的作用，穩(wěn)定表達CreER,?？墒荂reER可能會泄露，既在沒有他莫昔芬的情況下,，也可能會敲LoxP（簡稱犯渾）,，這時候應該加入雙重保障。 Cre調控方式 Inducible Cre: These constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) to activate Cre. One advantage of this system is tight temporal regulation. （1）誘導Cre：這些結構需要添加外源性配體(如他莫昔芬)來激活Cre。這個系統(tǒng)的一個優(yōu)點是嚴格的時間管理--這一個是我們最常用到的,！ Promoter-regulated Cre: The promoter region defines the areas in which Cre will be expressed. Cre may be expressed globally under a broadly active promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e.g. Rho-Cre is expressed in the retina). （2）啟動子調控的Cre：啟動子區(qū)域定義了Cre表達的區(qū)域,。Cre可能在廣泛活躍的啟動子(如CAG)下全局表達，也可能僅在特定啟動子下的細胞子集中表達(如Rho-Cre在視網(wǎng)膜中表達),。 Fluorescent Cre: The fusion of Cre to a fluorescent reporter enables visualization of Cre expression. （3）Cre與熒光報告基因的融合使Cre表達可以可視化--可以直接看見熒光哦,！ Optimized Cre: Codon-optimized Cre (iCre) is expressed at higher levels in mice than P1 bacteriophage Cre, facilitating high rates of Cre-driven recombination. CREM (or Cre-M) has been engineered to contain an intron, preventing Cre expression when cloning in E. coli. This alteration enables the generation of a single vector containing Cre and a floxed construct (unmodified Cre will cause recombination in E. coli, deleting the floxed portion of a construct during the cloning process). VCre and SCre are alternative Cre recombinases that recognize specific mutant loxP sites, VloxP and SloxP sites respectively. （4）嗯......好復雜 Split Cre: Cre recombinase is split in half into N and C terminal Cre fragments (NCre and CCre, respectively) and placed under the control of different promoters. Expression of both N and CCre in the same cell type allows for recombination of LoxP flanked DNA sequences. （5）將Cre重組酶分為N和C端Cre片段(分別為NCre和CCre)，置于不同啟動子的控制下,。N和CCre在同一細胞類型中的表達允許LoxP側邊DNA序列的重組,。 2. 什么是LoxP loxP是一段長34bp的DNA序列，是重組酶識別的位點,，被稱為loxP位點(10cus of X—over in P1),。 參考資料： https://info./blog/introduction-to-cre-lox https://www./cre-lox/ 這些LoxP結構允許crec調控基因表達，Cre可激活或抑制基因表達,，這取決于其結構,。常見構造類型包括： （1）依賴于Cre的基因表達：在感興趣的基因上游，在任何一側（通常稱為“l(fā)ox-stop-lox”或“LSL”盒）放置一個帶有l(wèi)oxP位點的停止密碼子,，可以防止Cre缺失時的基因表達,。在Cre存在的情況下，停止密碼子被切除,，基因表達繼續(xù)進行,。  image.png （2）依賴于Cre的基因敲除：相反，將loxP位點放在基因的兩側(稱為“floxing”,，即“side by loxP”)將允許基因表達,，直到Cre出現(xiàn)，此時基因將被破壞或刪除,。  image.png （3）Cre-dependent shRNA Expression: Cre-lox被當做調節(jié)shRNA結構的開關. **在floxd-shRNA結構中,，Cre可切除shRNA，使基因表達恢復到生理水平,。在lox-STOP-lox shRNA構建中,，Cre表達促進shRNA表達。其實跟上面是一樣的,，只不過（1-2）說的是基因的表達,，這里是shRNA。  image.png （4）Gene Switch: 在這里有兩個目的基因：A and B. 當Cre缺失時,，只有A的轉錄是正常的,，Cre表達時則切除基因A，改變閱讀框,，允許基因B在框內翻譯,。 https://www./figure/Gene-switch-strategy-using-cre-LOX-induced-translational-frameshift-A-Gene-1-flanked_fig3_11928708  image.png （5） FLEx Switch: 抑制A基因表達的同時激活B基因。For more information on FLEx switch and what you can do with it read Addgene's Blog on FLEx Vectors。對它感興趣的話,，請進一步閱讀學習,。 3. 什么是AAVS1 為啥要突然提到AAVS1？是因為以上提到的LoxP我們已經(jīng)知道,，應該把LoxP放在目的基因的內含子中（中間是外顯子,，最好是功能區(qū)外顯子）。而Cre想要穩(wěn)定表達怎么辦呢,？這時候就要借助AAVS1位點的作用了,。已有試劑盒可以做到 AAVS1 位點（又稱為 PPP1R2C 位點）位于人類基因組第19號染色體，是一個經(jīng)過驗證,、能確保轉入 DNA 片段預期功能的“安全港”位點,。該位點是一個開放的染色體結構，能保證轉入基因能被正常轉錄,。另外很重要的一點是在該位點插入外源目的片段對細胞無已知的副作用,。 |
|
|
