隨著研究的不斷深入，現代神經科學需要關注大量不同種類的神經元或膠質細胞,，如多種GABA能中間神經元,、小膠質細胞等。遺憾的是,，這些細胞往往沒有成熟的,、不泄露的啟動子供選擇，那么在這種情況下,，我們該如何實現細胞類型特異性的標記或操作呢,？答案便是借助Cre-LoxP或Flp-FRT等重組酶系統(tǒng)。

簡單來說,，這類重組酶系統(tǒng)是通過特異位點重組酶(Site-specific recombinases, SSRs)介導重組酶特異識別位點(Recombination tar-get sites, RTs)間的重組,，來實現特異位點的基因敲除,、基因插入、基因翻轉和基因易位等操作,。由于該技術能夠有效克服其他類型重組技術的非特異性或重組效率低等缺點,，近年來已逐漸在功能基因研究領域占據了主導地位。

Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種重組酶,，于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現,，其基因編碼區(qū)序列全長1029bp，為38kDa大小的,、由343個氨基酸組成的多肽單體蛋白,。Cre重組酶的C-末端結構域包含催化活性位點，能夠催化DNA分子中特定位點之間的重組,。

LoxP是Locus of X-overP1的縮寫,，是位于P1噬菌體中長度為34bp的一段序列，由兩個13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成,，反向回文序列是Cre重組酶的識別和結合區(qū)域,，間隔序列決定LoxP序列的方向。

Cre重組酶不僅具有催化活性,，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列,，即loxP位點,，使兩個loxP位點間發(fā)生基因重組。Cre重組酶無需借助任何輔助因子,，可作用于多種結構的DNA底物,，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA,。此外,，Cre重組酶的活性可控，可以使之只在某類特定細胞類型中表達,，也可以使之由特定的外部刺激（如化學信號,、熱刺激）觸發(fā)表達。在神經科學領域,，此技術可以用于對神經環(huán)路的特異性標記,、特異細胞類型中內源基因的功能研究及構建小鼠模型等。

一般而言,，當細胞基因組內存在兩個LoxP位點時,，Cre重組酶會誘導兩個LoxP位點間的序列發(fā)生重組。首先,，Cre重組酶結合到兩個13bp的回文序列形成二聚體,，然后這個二聚體和另外一個loxP位點上的二聚體結合,，形成四聚體。LoxP位點是有方向的,，形成四聚體的兩個loxP位點是平行的,，隨后這兩個loxP位點間的雙鏈DNA被Cre重組酶切掉，然后切口在DNA連接酶的作用下重新連接,。

重組的結果取決于兩個loxP位點的方向,，主要有以下幾種可能：

① 如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同,，Cre重組酶能有效地刪除兩個LoxP位點間的序列（Deletion）（圖1A）,；

② 如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反,，Cre重組酶能誘導兩個LoxP位點間的序列翻轉（Inversion）（圖1B）,；

③如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位,，即基因轉座（Translocation）（圖1C）;

④如果四個loxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上,，Cre重組酶能誘導loxP間的序列互換（cassette exchange）（圖1D）。

圖1 Cre-loxP誘導基因重組的方式

Cre-LoxP系統(tǒng)可以實現對基因的操控,，根據Cre重組系統(tǒng)誘導基因重組的方式,，我們可以通過如下兩種策略實現Cre依賴的基因表達：

1、LSL序列（條件性基因選擇）

將LoxP2和轉錄終止信號盒（Transcription STOP cassette）插入啟動子和目的基因之間,，轉錄終止信號盒兩端各有一個同向的LoxP位點,，組成LoxP-STOP-LoxP-gene模式，即LSL序列,。

此情況下,，在無Cre酶存在的細胞中，轉錄終止信號盒下游靶基因完全不表達,，但如果細胞中含有Cre酶,，基因重組中的Deletion過程發(fā)生，移除轉錄終止信號盒,，進而表達目的基因,。這是一種簡單有效的辦法，我們可以通過LSL的設置,，有選擇性地（根據Cre品系動物選擇）在某些細胞中表達基因,。但此法的缺點是可能會發(fā)生轉錄的泄露，即轉錄時跳過STOP序列,，在無Cre酶的作用下也會表達基因,。

圖2 Cre依賴的基因表達-LSL策略

2、 DIO/DO序列

通過引入兩對不相容的反向Lox位點-LoxP和Lox2272，經過兩組Lox位點的兩輪重組可達到一種穩(wěn)定狀態(tài),。也就是可以通過Cre重組酶的存在與否來控制基因的表達,。

這種策略被稱為DIO（Cre-on）或DO（Cre-off）。在這種策略下,，任一對Lox位點間的序列會在Cre的作用下發(fā)生可逆的快速翻轉,，之后Cre重組酶馬上不可逆地切割翻轉后的同向Lox位點，只留下翻轉后的基因和單獨的LoxP,、Lox2272位點,，防止基因的再次翻轉。

這種巧妙的設計讓科研人員可以在病毒載體中構建DIO和反向基因,，感染Cre陽性細胞后,，可以讓Cre陽性的細胞表達基因，是為DIO結構,；如果預先包裝的基因是正向,，那么Cre陽性的細胞則不表達基因，其余細胞表達基因,，是為DO結構,。因此，人為操控基因表達變成了現實,。

圖3借助LoxP和Lox2272的FLEX策略實現Cre依賴的基因表達 （Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008）

1,、特異性標記/環(huán)路示蹤

可以借助Cre品系的小鼠和Cre依賴表達的病毒載體結合使用，達到特異性對某些細胞的標記和操控目的,。

運用神經示蹤技術對大腦特定神經環(huán)路的結構和功能進行解析時,，亦可以借助Cre重組酶系統(tǒng)和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro,、rAAV2/1）結合適用，達到特異性對神經環(huán)路標記和功能研究的目的,。

圖4 基于rAAV1-Cre順行單級跨突觸示蹤 （Zheng P’s lab., Sci Adv., 2019）

2,、病毒依賴的基因重組

由于轉基因動物依賴的基因重組存在耗時長、成本高,、區(qū)域或者組織特異性不高等不足,，現在越來越多的科研工作者開始采用比較靈活的方式使用Cre-loxP系統(tǒng)。通過病毒引入Cre或loxP元件,，結合一種轉基因小鼠是比較常用的方式（圖3）,。

相比于轉基因動物依賴的基因重組，病毒依賴的基因重組有以下優(yōu)點：

更強的區(qū)域特異性：由于病毒可以通過局部注射的方式保證區(qū)域特異性感染,，再加上驅動Cre基因的特異性啟動子,，能夠實現更強的區(qū)域和細胞特異性的基因重組；

更少的花費：購買轉基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉基因動物的飼養(yǎng),、基因型鑒定都需要不少的人力,、物力，而病毒的制備,、保存和注射所花的費用相對來說是比較少的,；

更短的實驗周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而轉基因小鼠的交配過程特別耗時間,，因此采用注射病毒到轉基因小鼠體內的方式,，可以大量縮短實驗周期。

圖5 LoxP動物結合表達Cre的病毒進行基因敲除

Cre-loxP系統(tǒng)的優(yōu)勢

在當今世界上,，Cre-loxP系統(tǒng)是在神經系統(tǒng)中應用最廣泛的條件性基因敲除工具,，主要是因為該系統(tǒng)有如下優(yōu)點：

1.高效性：Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片段形成復合物之后，可以提供足夠的能力引發(fā)之后的DNA重組過程,，重組過程簡約高效,；

2.特異性強：loxP位點是一段含回文序列結構和中間有間隔的34bp元件，這種結構保證了loxP序列的唯一性,，從而保證基因重組的特異性很強,；

3.可應用范圍廣：Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質，可以在生物體不同的組織,、不同的生理條件下發(fā)揮作用,，所以說Cre-loxP系統(tǒng)的可應用范圍非常廣；

4.可由二型啟動子啟動表達：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種二型啟動子驅動,，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細胞,、組織、器官或者在不同的發(fā)育階段或不同的勝利條件下表達,，從而實現較高的組織和細胞特異性,。

經過現代基因工程方法對Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系統(tǒng)實現了更加豐富的條件性重組策略,。

1,、對Cre元件的改造

對Cre元件的改造提高了Cre重組酶的活性，并且實現了藥物可誘導性,。例如,，通過在Cre元件上引入真核細胞核定位序列NLS，Cre重組酶能在低表達豐度下實現重組,，這對于一些低豐度的啟動子很重要,。

另外，在Cre元件的C端接上一段改造過的配體結合結構域LBD,，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內,，當人工合成的激素分子結合到Cre-LBD受體后，蛋白構象改變并進入核內，介導基因重組,，目前使用最多的是tamoxifen誘導的CreERT2突變體,，它的LBD來自于雌激素受體ER分子，當有tamoxifen的時候,，Cre才能介導基因重組,，這樣通過控制tamoxifen的注射時間，可以實現對基因重組時間特異性的調控,。

圖6 tamoxifen誘導的Cre-ER系統(tǒng) （Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res., 2018）

2,、對loxP元件的改造

loxP元件也有一些突變體，間隔區(qū)和回文序列都可以進行突變,，突變后的序列依然能被Cre重組酶識別和重組,，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導基因重組，而不能和未突變的loxP序列匹配,，這樣將不同的loxP序列組合用于控制多個基因（如上文所述的lox2272位點）,，在同一Cre重組酶的作用下，可以實現多序列的基因重組,，產生非常多元的重組結果,。例如彩虹腦（Brainbow）技術絢麗多彩的熒光標記效果正式基于對loxP序列的改造實現。

除Cre-LoxP系統(tǒng)外,，類似的還有與Cre-LoxP系統(tǒng)無交叉影響的vCre-vLoxP,、sCre-sLoxP系統(tǒng)，及Flp-FRT/F5系統(tǒng)和Dre-Rox1/Rox2系統(tǒng),，對應的表達方案分別為fDIO和dDIO系統(tǒng),。

多套重組酶體系的存在為研究中設計多個限制條件提供了便利，靈活應用Cre,、Flp,、Dre重組酶系統(tǒng)將有助于更深入課題的開展。

1,、Flp-FRT系統(tǒng)

Flp-FRT系統(tǒng)與Cre-loxP類似,，也是由一個重組酶和一段特殊的DNA序列組成。其中,，Flp（flippase recombination enzyme）重組酶，是從酵母細胞內被發(fā)現的,，其基因全長1272bp,，為48kDa大小的、由423個氨基酸組成的多肽單體蛋白,。

FRT是Flp的識別位點,，全長48bp，由3個13bp的反向回文序列和8bp的間隔序列共同組成。與間隔序列相鄰的兩個反向回文序列是Flp重組酶的識別和結合區(qū)域,，間隔序列是重組發(fā)生的區(qū)域,，也決定了整個序列的方向。

Flp-FRT系統(tǒng)與Cre-loxP誘導基因重組的方式類似,，這兩個系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是這個重組酶（Cre和Flp）具有不同的最佳反應溫度,，有研究發(fā)現，Cre重組酶的最佳溫度為37℃,，而Flp重組酶為30℃,。后來科學家們，構建了Flp突變體--Flpo,，其在37℃也表現出較好的耐熱性,。

2、Dre-Rox系統(tǒng)

Dre（D6 site-specific DNA recombinase）也是從噬菌體中發(fā)現的一種酪氨酸重組酶,，其識別的是32bp的DNA序列rox,，包含兩個14bp反向回文序列和4bp的中間間隔序列。Dre重組酶和Cre重組酶具有特異性,，Dre重組酶不能識別loxp位點,，同時Cre重組酶也不能識別rox位點。

圖7 Cre\Flp\Dre系統(tǒng)比較 （Lief E Fenno, et al., Nat Methods., 2014）

3,、vCre-vloxp和sCre-sloxp系統(tǒng)

vCre和sCre均為Cre重組酶的同源蛋白,，但他們與Cre的同源性很低，可以特異性識別vloxp和sloxp,。

圖8 借助vCre-vloxp系統(tǒng)標記mPFC-vHPC的投射 （圖片來源于和元生物）

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本文來源于“和元生物”,。