基因敲除是自80年代末發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù),，是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。

通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理,，將目的基因用一段外源DNA序列（多采用篩選基因新霉素）替代,，獲得在整個(gè)發(fā)育時(shí)期的全身所有組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。

然,，其缺點(diǎn)有二：

01

很多基因經(jīng)常時(shí)多組織多器官表達(dá)的,，傳統(tǒng)的全身敲除小鼠的表型是該基因在小鼠的所有組織中敲除的結(jié)果，很難研究該基因在某個(gè)特定組織中的作用,；

02

很多基因（約15%[1]）的突變和缺失極易造成胚胎發(fā)育異常,，導(dǎo)致胚胎致死或其他基因的表達(dá)失調(diào)致動物出生不久既死

問

怎樣才能更準(zhǔn)確地研究基因在某組織中的功能，避免胚胎致死或動物出生后不久就死亡這種情況呢,？

答

咱們可以采用條件性基因敲除策略,，以Cre/loxP為基礎(chǔ)，利用組織特異性啟動子特異性控制Cre在特定組織的表達(dá),，以實(shí)現(xiàn)在特定組織細(xì)胞中對目的基因的敲除或改造,，也可以在Cre后加上ERT2，以實(shí)現(xiàn)在動物的特定發(fā)育時(shí)期對目的基因的敲除或改造,。

by ALFREDPECHISKER[2]

總而言之就是：通過Cre/loxP系統(tǒng),，想讓目的基因在什么組織中敲除就能在什么組織中敲除，想讓目的基因在什么時(shí)間敲除就什么時(shí)間敲除,！是不是很酷?。??

那Cre/loxP系統(tǒng)究竟是什么呢,？我們來詳細(xì)了解一下吧,！

Cre-loxP重組酶系統(tǒng)

Cre-loxP重組是一種特定位點(diǎn)的重組酶技術(shù)，可在DNA的特定位點(diǎn)上執(zhí)行刪除,、插入,、易位及倒位，用該系統(tǒng)可以針對特定的細(xì)胞類型或采用特定的外部刺激,，對細(xì)胞中DNA進(jìn)行修改,。在真核和原核系統(tǒng)中均適用,。

1987年Brian Sauer博士報(bào)道了Cre-loxP重組系統(tǒng)可用在有絲分裂和非有絲分裂細(xì)胞中操作特定位點(diǎn)的特異性重組，最初用于激活哺乳動物細(xì)胞系的基因表達(dá)[3-4],。隨后,， Jamey Marth博士實(shí)驗(yàn)室的研究人員也證明了，Cre-Lox重組可以用在特定的轉(zhuǎn)基因動物T細(xì)胞中,，以高效率的方式刪除loxp兩側(cè)的DNA序列[5],。

Cre重組酶

1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)(有些文獻(xiàn)中也稱為“環(huán)化重組酶”)，由343個(gè)氨基酸組成的38kDa蛋白,，有4個(gè)亞基和2個(gè)域:較大的羧基(C端)域和較小的氨基(N端)域,。是一種位點(diǎn)特異性的DNA重組酶，能特異識別loxp位點(diǎn),，介導(dǎo)loxp位點(diǎn)間的序列刪除或重組,。

loxP位點(diǎn)

locus of X-over P1來源于噬菌體P1，是一段長度為34bp的DNA序列,，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)不對稱的8bp間隔區(qū)組成,。反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了loxP位點(diǎn)的方向,。

13bp 8bp 13bp

ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT

（N 表示堿基可能發(fā)生變化）

Cre-loxP重組酶系統(tǒng)的作用方式

Cre重組酶識別loxP位點(diǎn)兩端的反向重復(fù)序列并結(jié)合形成二聚體,，然后此二聚體與另一個(gè)loxP位點(diǎn)上的二聚體結(jié)合形成一個(gè)四聚體,。LoxP位點(diǎn)是有方向性的,，四聚體連接的兩個(gè)位點(diǎn)在方向上是平行的。然后兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的DNA序列被Cre重組酶切斷,。接著,，DNA連接酶快速高效地將這些鏈連接起來。重組的結(jié)果取決于loxP位點(diǎn)的位置和方向,。

主要會發(fā)生以下三種情況：

1

如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相同,，Cre重組酶介導(dǎo)loxP間的序列切除；

2

如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反,，Cre重組酶介導(dǎo)loxP間的序列反轉(zhuǎn),；

3

如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶介導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位,。

然而,，另需要注意的是，A,、B,、C三種情況也有可能會發(fā)生逆轉(zhuǎn)，可以通過引入兩對不同的loxP位點(diǎn),，經(jīng)過兩組loxP位點(diǎn)的兩輪重組即可達(dá)到一種穩(wěn)定狀態(tài),。在基因編輯動物中,，最常用的是A、B兩種情況,，這兩種基因編輯方式也可以簡單的概括為“正向刪除,，反向反轉(zhuǎn)”。

Cre-loxP重組酶系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

1

時(shí)空特異性

除了實(shí)現(xiàn)目的基因在特定組織（比如利用組織特異性表達(dá)啟動子+Cre）中的改造外,，還可以可以實(shí)現(xiàn)目的基因在特定時(shí)間（比如在Cre后加ERT2）的改造,，那ERT2是什么？怎么實(shí)現(xiàn)在特定時(shí)間的調(diào)控呢,？（預(yù)知后事如何,，且聽下回分解！）

2

高效性

《基因打靶技術(shù)》一書中闡述過兩個(gè)loxP之間的距離在1.5-3.5kb之間時(shí),，敲除效率可到99%,，這也只是經(jīng)驗(yàn)值，目前很多研究都可以敲除更長的片段,！

3

應(yīng)用范圍廣

真核及原核均適用,，不同組織、不同生理?xiàng)l件性均可起作用,。

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參考文獻(xiàn)

[1] https://www./12514551/

[2] https://www.scq./targeting-your-dna-with-the-crelox-system-2/

[3] Sauer, B. Functional expression of the Cre-Lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1987, 7(6): 2087–2096.

[4] Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988, 85(14): 5166–5170.

[5] Orban P C, Chui D, Marth J D. Tissue– and site–specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 89(15): 6861–6865.

封面圖片來源于Wikipedia

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