RKO 細(xì)胞中DIP2C 的缺失在研究人類(lèi)癌癥中的作用

Disco-Interacting Protein 2 Homolog C （DIP2C），是一種在人體組織和成人腫瘤中高水平表達(dá)的非特征基因,，在外顯子組范圍內(nèi)的激素突變分析中被確定為推定的癌癥基因,。為了研究DIP2C失活在人類(lèi)癌癥中的作用并確定受該基因活性影響的過(guò)程，Larsson等人利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了人類(lèi)DIP2C敲除RKO細(xì)胞系,。結(jié)果顯示,，RKO 細(xì)胞中DIP2C 的敲除會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增大和生長(zhǎng)遲緩。并且Larsson等人揭示了表達(dá)水平會(huì)受到DIP2C缺失影響的780 個(gè)基因,，包括編碼CDKN2A基因的腫瘤抑制基因,、編碼上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)節(jié)因子的ZEB₁以及編碼乳腺癌干細(xì)胞的CD₄₄和CD₂₄等等。DNA 甲基化分析顯示超過(guò)30,000個(gè)基因位點(diǎn)受差異甲基化影響，其中大部分在DIP2C缺失后發(fā)生低甲基化,。,，而啟動(dòng)子區(qū)域 DNA 甲基化的變化與基因表達(dá)的變化密切相關(guān)。DIP2C敲除后的RKO細(xì)胞具有更高的創(chuàng)傷閉合容量,，所以DIP2C的缺失將會(huì)觸發(fā)癌細(xì)胞中大量的DNA甲基化和基因表達(dá)變化,、細(xì)胞衰老和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化^[1]。

圖   DIP2C的缺失導(dǎo)致基因表達(dá)的改變

篩選最具耐藥性的因子,，推進(jìn)抑制劑的研發(fā)進(jìn)程

壞死的細(xì)胞死亡途徑是人類(lèi)病原體防御的一個(gè)關(guān)鍵組成部分,，在組織穩(wěn)態(tài)過(guò)程中可以被異常抑制，從而導(dǎo)致多種類(lèi)型的組織損傷和疾病,。雖然含有RIPK1,、RIPK3和MLKL的壞死體激酶信號(hào)復(fù)合物的形成機(jī)制已被熟知，但其調(diào)控和效應(yīng)功能的其他機(jī)制仍然有待發(fā)現(xiàn),。Callow等人通過(guò)CRISPR/Cas9進(jìn)行了全基因敲除篩選了19,883個(gè)小鼠蛋白編碼基因,，并且通過(guò)大規(guī)模轉(zhuǎn)導(dǎo) RKO 細(xì)胞獲得的 sgRNA 參考文庫(kù)，篩選出對(duì)細(xì)胞壞死具有耐藥性的因子,，然后鑒定了112個(gè)壞死調(diào)控因子和介質(zhì),，包括59個(gè)新的候選通路成分，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有壞死誘導(dǎo)的情況下細(xì)胞生長(zhǎng)基本不會(huì)受到任何影響,。他們還進(jìn)一步表明了一些組織特異性或應(yīng)激反應(yīng)途徑可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)RIPK1來(lái)防止受調(diào)控的細(xì)胞死亡,。上述研究結(jié)果表明，對(duì)RIPK1功能的進(jìn)一步探索對(duì)于推進(jìn)了新的治療干預(yù)策略或臨床抑制劑的開(kāi)發(fā)
^[3]具有重要作用,。

圖 耐藥性因子篩選

全基因組敲除后的RKO 細(xì)胞對(duì)于放療CRC提供了至關(guān)重要的幫助

結(jié)直腸癌 (CRC) 在最常診斷的癌癥中排名前三,，并且是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。除了手術(shù)切除和化療,，放療的佐劑也起著關(guān)鍵作用,，可以延長(zhǎng)患者的生存率。然而在放療過(guò)程中約有50%的患者會(huì)對(duì)放療佐劑產(chǎn)生耐藥性,，從而導(dǎo)致療效不理想,、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,，確定放射抗性的潛在機(jī)制,，可以改善結(jié)直腸癌患者的治療結(jié)果。Yu等人通過(guò)在RKO結(jié)直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行基因組規(guī)模的CRISPR 敲除篩選,，并結(jié)合 NGS 測(cè)序,，以探索涉及結(jié)直腸癌放射抗性的調(diào)節(jié)因素，最終得到了3個(gè)候選基因,。他們發(fā)現(xiàn)microRNA-5197-5p（miR-5197）可以顯著增強(qiáng)IR對(duì)RKO的細(xì)胞毒性,。Yu等人通過(guò)進(jìn)一步的機(jī)制研究,，證明了miR-5197 直接靶向 CDK6 并抑制其在 RKO 細(xì)胞中的表達(dá)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在 G1/S 期并抑制細(xì)胞分裂,，因此,，miR-5197 增強(qiáng)了放射敏感性。研究結(jié)果表明,，miR-5197 可能是調(diào)節(jié) CRC 細(xì)胞放射敏感性的關(guān)鍵因素,，并為開(kāi)發(fā)對(duì) IR 具有抗性的 CRC 患者的治療策略提供了幫助^[4]。

圖 通過(guò)全基因組 CRISPR 敲除篩選鑒定與 CRC 放射抗性相關(guān)的候選基因