2013年，Nature雜志刊登了題為：Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges的circRNA研究文章（圖1）,，發(fā)現(xiàn)circRNA-ciRS7,，含有miR7的470個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)。ciRS7在人體的許多組織中穩(wěn)定表達(dá),，通過海綿作用抑制miR7活性來增加miR7靶基因的表達(dá)水平,。而miR7直接靶向幾種致癌基因，涉及許多不同的人類癌癥,。

圖1--circRNA作為miRNA海綿作用的開山之作

這是首次提出并證實(shí)circRNA是作為miRNA的海綿起調(diào)控作用,，自此circRNA相關(guān)研究快速增長(zhǎng)，逐漸成為非編碼RNA領(lǐng)域最火熱的明星分子,。

目前circRNA研究主要有以下三個(gè)方面：

1.miRNA分子海綿,，circRNA含有大量的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，具有miRNA海綿作用,，進(jìn)而間接調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá),。

2.調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，circRNA也可以通過與RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合來調(diào)控蛋白功能,，比如通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來抑制基因的轉(zhuǎn)錄,。

3.編碼功能，circRNA雖然屬于非編碼RNA,，但是也有部分circRNA可以編碼多肽,，通過該多肽行使調(diào)控功能。

3月16日,，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市第一醫(yī)院王書奎教授課題組在 Cell Death＆Disease雜志發(fā)表題為：CircHIPK3 promotes colorectal cancer growth and metastasis by sponging miR-7的circRNA研究文章（圖2）,。證實(shí)circHIPK3通過作為miR-7的海綿來促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。表明circHIPK3作為CRC的預(yù)后生物標(biāo)志物可能具有相當(dāng)大的潛力,，c-Myb/ circHIPK3 / miR-7軸的治療靶向可能是CRC患者的有前景的治療方法,。

圖2

結(jié)腸直腸癌（CRC）是全球第三大最常見的惡性疾病，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大原因,。因此,，發(fā)現(xiàn)用于預(yù)后預(yù)測(cè)的新潛在生物標(biāo)志物并深入闡明CRC惡性腫瘤的確切分子機(jī)制可能改善CRC患者的治療。

circRNA與人類疾病尤其是癌癥密切相關(guān),，由于其豐富性和穩(wěn)定性,，它們可能成為更好的生物標(biāo)志物。 circHIPK3是一種特別豐富的circRNA,，已被證實(shí)參與代謝失調(diào)和腫瘤發(fā)生,。

我們先看文章的結(jié)論

c-Myb作為轉(zhuǎn)錄因子,，促進(jìn)circHIPK3的表達(dá)，吸附miR-7,，從而降低miR-7對(duì)癌基因的抑制作用,，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

接下來我們?cè)敿?xì)解讀一下這篇文章

1,、circHIPK3在CRC中有明顯的表達(dá)上調(diào),，而circHIPK3表達(dá)的增加預(yù)示著預(yù)后不良。

circHIPK3（hsa_circ_0000284）來自HIPK3基因Exon2,，其拼接的成熟序列長(zhǎng)度為1099bp， 熒光原位雜交（FISH）測(cè)定顯示circHIPK3主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖3）,。

圖3

接下來,，我們研究了circHIPK3在CRC細(xì)胞系和組織中的表達(dá)水平。 與正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞（FHC）相比,，circHIPK3在CRC細(xì)胞系（HCT116,，HT29，SW480,，SW620,，DLD1）中的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4）。

圖4

通過分析Kaplan-Meier生存曲線（p <0.001）,，circHIPK3高表達(dá)的CRC患者的總體存活顯著低于circHIPK3低表達(dá)的患者（圖5左）,。進(jìn)一步的Cox多因素生存分析顯示，circHIPK3的高表達(dá)是CRC患者生存差的獨(dú)立預(yù)后因素（圖5右）,。這些結(jié)果表明circHIPK3上調(diào)作為CRC發(fā)展的早期事件并且在CRC進(jìn)展中具有重要作用,。

圖5

2、轉(zhuǎn)錄因子c-Myb是circHIPK3表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子

之前有研究顯示在糖尿病患者中c-Myb促進(jìn)circHIPK3的轉(zhuǎn)錄而使其富集,。我們發(fā)現(xiàn)c-Myb在CRC細(xì)胞系（圖6a）和組織（TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)）（圖6b）中顯著過表達(dá),，這與以前的研究一致。

圖6

在HCT116和HT29細(xì)胞系中使用siRNA敲低c-Myb的表達(dá),，circHIPK3表達(dá)顯著降低,；過表達(dá)c-Myb，則circHIPK3表達(dá)顯著增加（圖7a）,。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示c-Myb過表達(dá)顯著增強(qiáng)了circHIPK3啟動(dòng)子中含有c-myb位點(diǎn)的載體的熒光素酶活性,，而突變型c-Myb結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性未受影響（圖7b）。以及ChIP實(shí)驗(yàn),，進(jìn)一步表明c-Myb通過直接結(jié)合circHIPK3啟動(dòng)子區(qū)域來增加circHIPK3的表達(dá),。

圖7

3、沉默circHIPK3會(huì)抑制CRC細(xì)胞增殖,、遷移,、侵襲并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

為了研究circHIPK3在CRC中的生物學(xué)功能，使用siRNA針對(duì)circHIPK3的連接位點(diǎn)以沉默HCT116和HT29細(xì)胞系中的circHIPK3表達(dá)。這些siRNA顯著降低circHIPK3表達(dá)水平,，但對(duì)其線性異構(gòu)體沒有影響（圖8a）,。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示circHIPK3敲低顯著抑制HCT116和HT29細(xì)胞系的克隆形成能力（圖8b）。通過CCK8實(shí)驗(yàn)（圖8c）和EdU測(cè)定（圖8d）測(cè)量細(xì)胞增殖,，顯示沉默circHIPK3會(huì)顯著抑制這兩種細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖,。

圖8

si-circHIPK3組中，存在更多的凋亡細(xì)胞（圖9e）,。 circHIPK3沉默顯著阻礙HCT116和HT29細(xì)胞遷移（圖9f）和侵襲（圖9g）,。 這些數(shù)據(jù)共同表明circHIPK3的沉默可以延緩CRC細(xì)胞的進(jìn)展。

圖9

4,、circHIPK3可以在CRC細(xì)胞系中吸附miR-7

為了研究circHIPK3是否可以在CRC細(xì)胞中起到“miRNA海綿”的作用,，通過CircNet數(shù)據(jù)庫(kù)選擇前十位（miR-599，miR-93-3p,，miR-365a-5p,，miR-365b-5p，miR-421,，miR-570-3p,，miR-597-5p，miR-7,，miR-1207-3p,，miR-124-5p）候選miRNA。

pull down實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR分析顯示miR-7是唯一一種被circHIPK3探針大量下拉的miRNA （圖10）,。

圖10

利用生物素標(biāo)記的miR-7及其突變模擬物在過表達(dá)circHIPK3的HCT116和HT29細(xì)胞中pull down circHIPK3,，結(jié)果顯示野生型miR-7捕獲更多circHIPK3 （圖11d）。螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明miR-7的過表達(dá)顯著降低含有完整circHIPK3序列的熒光素酶活性,，但不影響HCT116和HT29細(xì)胞中具有突變型miR-7結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶活性（圖11e）,。FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示circHIPK3和miR-7共定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖11f）。

圖11

qRT-PCR結(jié)果顯示miR-7隨著臨床分期的增加而顯著下調(diào)（圖12g）,。miR-7在HCT116和HT29細(xì)胞系中的表達(dá)隨著circHIPK3的過表達(dá)而減少,，隨著circHIPK3的沉默而增加（圖12h）。 circHIPK3的表達(dá)與CRC組織中miR-7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖12i）,。這些數(shù)據(jù)表明circHIPK3在CRC中充當(dāng)miR-7的miRNA海綿,。

圖12

5、circHIPK3的過表達(dá)有效地逆轉(zhuǎn)miR-7對(duì)CRC細(xì)胞進(jìn)展的抑制作用

miR-7是一種眾所周知的腫瘤抑制因子,，參與許多人類腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展,。miR-7的過表達(dá)顯著抑制了CRC細(xì)胞的增殖、遷移,、侵襲和凋亡（圖13）,。circHIPK3質(zhì)粒和miR-7模擬物共轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞比僅用miR-7模擬物轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞出現(xiàn)更多克?。?strong>圖13a）。 與單獨(dú)的miR-7過表達(dá)相比,，過表達(dá)miR-7與circHIPK3一起促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖（圖13b）,。 miR7 circHIPK3組與單獨(dú)miR7組相比凋亡細(xì)胞較少（圖13c）。 與單獨(dú)miR-7過表達(dá)相比,，miR-7和circHIPK3過表達(dá)阻礙HCT116和HT29細(xì)胞遷移（圖13d）和侵襲（圖13e）,。 與miR-7過表達(dá)或circHIPK3沉默相比，miR-7的過度表達(dá)與circHIPK3的敲低相結(jié)合顯示出對(duì)CRC細(xì)胞惡性表型更強(qiáng)的抑制作用,。

圖13

為證實(shí)circHIPK3是否通過提高miR-7靶標(biāo)的癌基因的的表達(dá)來發(fā)揮促腫瘤作用,，選擇一組與生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的miR-7靶基因做qRT-PCR分析，結(jié)果顯示circHIPK3的過表達(dá)會(huì)增加FAK,，IGF1R,，EGFR和YY1的表達(dá)，circHIPK3的敲低會(huì)降低FAK,，IGF1R,，EGFR和YY1的表達(dá)（圖14f）,。與僅用miR-7模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,，在用miR-7模擬物和circHIPK3載體共轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞（HCT116和HT29）中FAK，IGF1R,，EGFR和YY1的表達(dá)顯著增加（圖14g）,。上述結(jié)果表明circHIPK3的過表達(dá)通過提高miR-7并隨后促進(jìn)FAK，IGF1R,，EGFR和YY1表達(dá),，從而有效地逆轉(zhuǎn)了miR-7造成的CRC細(xì)胞侵襲性減弱。

圖14

6,、circHIPK3的沉默結(jié)合miR-7的過表達(dá)對(duì)模型動(dòng)物CRC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移顯示出抑制作用

為了進(jìn)一步評(píng)估circHIPK3是否在體內(nèi)發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用,，通過皮下注射等量的HCT116細(xì)胞（每組n = 8）建立了異種移植小鼠模型。約10天后,，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí),，單獨(dú)si-circHIPK3，單獨(dú)agomir-7或兩者聯(lián)合,，均每?jī)商炝鰞?nèi)注射連續(xù)兩周時(shí)間,。agomir-7或sicircHIPK3的腫瘤內(nèi)注射分別顯著降低腫瘤體積和重量。 更重要的是,，聯(lián)合sicircHIPK3和agomir-7組比si-circHIPK3或agomir-7單獨(dú)顯示更小的腫瘤體積和重量（圖15a）,。同樣，在mRNA和蛋白水平,，miR-7過表達(dá)或circHIPK3敲低均顯著降低miR-7靶向的原癌基因（FAK,，IGF1R,，EGFR，YY1）的表達(dá),，并且聯(lián)合組表現(xiàn)出這些癌基因的較低表達(dá),。分析還顯示與si-circHIPK3或agomir-7組相比，si-circHIPK3 agomir-7組中Ki67,，MMP9陽性細(xì)胞和微血管密度降低以及半胱天冬酶-3陽性細(xì)胞增加（圖15b）,。

通過尾靜脈注射HCT116細(xì)胞到裸鼠中建立了轉(zhuǎn)移模型（每組n = 8）。在對(duì)照組中觀察到平均每只小鼠38個(gè)肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié),，在agomir-7或si-circHIPK3組中分別觀察到17和19個(gè),，而在聯(lián)合si-circHIPK3和 agomir-7組僅有6個(gè)轉(zhuǎn)移（圖15c）。這些數(shù)據(jù)表明circHIPK3的沉默會(huì)抑制CRC生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移,，并且與miR-7過度表達(dá)結(jié)合顯示出對(duì)腫瘤抑制的累加效應(yīng),。

圖15

這篇circRNA研究文章，做的是經(jīng)典的miRNA海綿作用的研究思路,，而且用了明星分子miR7,，依然發(fā)了6分的文章。不過不得不說,，文章的工作量比較大,，做了很多實(shí)驗(yàn)，而且整體思路非常嚴(yán)謹(jǐn),。