本研究中作者首先通過(guò)miRNA基因芯片分析,、Northern blot,、RT-PCR等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)，ISO處理14天后,，miRNA-223的表達(dá)量顯著上調(diào),，并且在患有心臟肥厚和心臟衰竭的人和小鼠心臟中miRNA-223的表達(dá)量也有明顯的上調(diào)，初步得出結(jié)論：miRNA-223參與調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭,。接下來(lái)作者利用miR-223過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠以及miR-223基因敲除轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證表型,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過(guò)表達(dá)小鼠成年后出現(xiàn)明顯的心肌肥厚和心臟衰竭癥狀，而miR-223基因敲除小鼠表型相反,，進(jìn)一步證明在活體內(nèi),，miR-223可以誘導(dǎo)心肌肥厚和心臟衰竭。

        接下來(lái)作者進(jìn)一步研究miR-223對(duì)心肌細(xì)胞的影響,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過(guò)表達(dá)細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的心肌肥大反應(yīng),，而miR-223敲除細(xì)胞中，ISO處理引起的心肌肥大反應(yīng)明顯被破壞,，說(shuō)明miR-223過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌肥厚,，而miR-223基因敲除會(huì)阻斷心肌肥厚。

        為了進(jìn)一步研究miR-223調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭的分子機(jī)制,，作者篩選了一些參與調(diào)控心肌肥厚的基因作為miR-223的靶標(biāo)候選基因,，然后通過(guò)western blot分析miR-223過(guò)表達(dá)和缺失突變體中上調(diào)以及下調(diào)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223可以顯著抑制ARC的表達(dá),，而前人已經(jīng)有研究報(bào)道ARC參與調(diào)控心肌肥厚和細(xì)胞凋亡,，所以初步推斷ARC可能是miR-223下游的靶標(biāo)位點(diǎn)。

        接下來(lái)作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn),，ARC的3′UTR含有潛在的miR-223的結(jié)合位點(diǎn),，然后通過(guò)Target Protector technology進(jìn)一步證明miR-223可以特異調(diào)控ARC的表達(dá)，ARC 3′UTR的翻譯活性受到miR-223的抑制,。

        接下來(lái)作者構(gòu)建了一個(gè)不帶ARC 3′UTR的腺病毒載體,，這種病毒載體對(duì)miR-223不敏感,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種腺病毒可以減弱ISO處理誘導(dǎo)的心肌肥厚反應(yīng)。然后作者通過(guò)ARC過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步證明了ARC可以保護(hù)心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭，減少細(xì)胞凋亡,。以上這些研究結(jié)論表明：在調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭的過(guò)程中，ARC是miR-223的下游靶標(biāo)位點(diǎn)。

        CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)話題，為了進(jìn)一步研究是否有CircRNA參與調(diào)控miR-223的表達(dá),，作者從CircRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)篩選出100個(gè)CircRNA，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證篩選到36個(gè)CircRNA,，然后通過(guò)Northern blot篩選到一個(gè)特異性表達(dá)的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR),。

然后作者通過(guò)RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)HRCR包含6個(gè)CircRNA的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，初步表明HRCR可以和miR-223結(jié)合,。接下來(lái)作者通過(guò)生物素標(biāo)記,，qRT-PCR，Northern bolt,，pull down assay,、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)手段，從正向以及反向兩個(gè)角度分別驗(yàn)證HRCR和miR-223之間的互作關(guān)系,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223和HRCR在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位現(xiàn)象,，HRCR可以直接結(jié)合到miR-223上。

        HRCR和miR-223存在互作,，而miR-223可以通過(guò)調(diào)控下游ARC的表達(dá),，進(jìn)而調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭，為了進(jìn)一步研究HRCR對(duì)ARC表達(dá)的影響,，作者構(gòu)建了HRCR過(guò)表達(dá)載體和基因敲除突變體,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRCR過(guò)表達(dá)載體中，ARC的表達(dá)量和活性顯著增加,，HRCR敲除突變體中,，ARC的表達(dá)量和活性顯著降低，并且HRCR可以消除miR-223對(duì)ARC表達(dá)的抑制作用,，說(shuō)明HRCR可以通過(guò)調(diào)控miR-223以及ARC的表達(dá),，進(jìn)而調(diào)控心肌肥厚。

參考文獻(xiàn)

Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.