|
編譯：小鹿同學(xué),，編輯：十九,、江舜堯。 原創(chuàng)微文,，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載,。 導(dǎo)讀神經(jīng)性腸病毒（EV）（如脊髓灰質(zhì)炎病毒）一直以來都被認(rèn)為與麻痹性疾病有關(guān),。雖然經(jīng)過努力，全世界的脊髓灰質(zhì)炎患者明顯減少,，但類似麻痹綜合征的另一種疾病——急性遲緩性脊髓炎（AFM）仍引起人們的擔(dān)憂，因?yàn)樗赡芘c另一種神經(jīng)性腸病毒有關(guān),。目前AFM的患病原因仍不清晰，而且在患者的腦脊液中可能因?yàn)槟c病毒RNA量很少或PCR引物等因素，使其很難被檢測(cè)到,。為了解決這一問題，本研究采用病毒捕獲高通量測(cè)序（VirCapSeq-VERT）技術(shù)及肽微陣列分析的方法對(duì)從AFM患者及非AFM三個(gè)對(duì)照組患者中采集的樣品進(jìn)行分析鑒定,，發(fā)現(xiàn)除了已報(bào)道過的腸病毒VP1衣殼蛋白12個(gè)氨基酸的保守肽區(qū)域,，還新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)存在于腸病毒EV-D68 VP1衣殼蛋白羧基端含22個(gè)氨基酸的線性保守肽區(qū)域。這個(gè)線性保守肽區(qū)域只對(duì)AFM組的樣品具有免疫反應(yīng)活性,，對(duì)照組沒有任何免疫活性,。本研究進(jìn)一步證明了腸病毒感染可能是急性遲緩性脊髓炎的一個(gè)發(fā)生原因，同時(shí)也為AFM疾病的診斷和治療提供了新的線索和途徑,。原名：Antibodies to Enteroviruses in Cerebrospinal Fluid of Patients with Acute Flaccid Myelitis 譯名：腸病毒抗體在急性遲緩性脊髓炎病人的腦脊液中 期刊：mBio IF：6.747 發(fā)表時(shí)間：2019年8月13日 通訊作者：W. Ian Lipkin 通訊作者單位： 美國(guó)紐約哥倫比亞大學(xué)梅爾曼公共衛(wèi)生學(xué)院感染與免疫中心 DOI：https:///10.1128/mBio.01903-19 本文的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組樣本數(shù)據(jù)均是從美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）收集的,，這些實(shí)驗(yàn)組急性遲緩性脊髓炎（AFM）樣本都已被CDC利用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（rRT-PCR）及Sanger測(cè)序法等分析過腸病毒及其種類。首先,，作者采用VirCapSeq-VERT技術(shù)和肽微陣列的方法對(duì)樣品進(jìn)行研究,。研究的對(duì)象主要是從2018年發(fā)病的14位AFM患者中（包括13名兒童和1名成年人）采集的成對(duì)腦脊液樣品和血清樣品、呼吸道樣品及糞便樣品,，也包括設(shè)置的三個(gè)對(duì)照組,，分別是（i）與AFM患者同一時(shí)間段收集的5位非AFM中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的兒童患者（NAC）及2019年收集的另一位NAC兒童患者；（ii）10名患有川崎癥的兒童（KDC）,；（iii）11名患有非AFM中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成年患者（AC）,。同時(shí)以2010年剛果采集的Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎樣品和脊髓炎腦脊液標(biāo)本樣品為檢測(cè)的陽性對(duì)照。然后,，研究者對(duì)于VirCapSeq-VERT技術(shù)產(chǎn)生的所有核苷酸進(jìn)行分析,，去除人類基因組和核糖體的序列后，分別使用MegaBlast和BLAST針對(duì)非冗余核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析剩余的病毒序列,。為了評(píng)估VirCapSeq-VERT技術(shù)在檢測(cè)腸病毒RNA時(shí)的效率,，作者通過qRT-PCR對(duì)腦脊液樣品中的腸病毒RNA進(jìn)行了定量分析。最后,，作者用樣品制成的血清芯片進(jìn)行肽微陣列分析,，并對(duì)高密度肽微陣列對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的免疫反應(yīng)活性進(jìn)行了分析和評(píng)估。 樣本的病毒學(xué)檢測(cè)和VirCapSeq-VERT測(cè)序分析實(shí)驗(yàn)組AFM和對(duì)照組NAC樣本中的腦脊液（CSF）樣品,、糞便樣品和呼吸道樣品均進(jìn)行了病毒學(xué)檢測(cè),。其中，作者在AFM組中的CSF樣品和7%糞便樣品中檢測(cè)到EV-A71,， 而對(duì)照組NAC中有一個(gè)樣本在CSF,、糞便和呼吸道樣品中均檢測(cè)到艾柯病毒25（E-25），在AFM組50%呼吸道樣品和NAC組33%糞便樣品中檢測(cè)到了腸病毒,。研究者通過VirCapSeq-VERT測(cè)序產(chǎn)生了大約320,000,000個(gè)單端reads,。經(jīng)過主機(jī)減法去除了88.7% reads,，剩余大約36,000,000個(gè) reads進(jìn)行下一步的分析。經(jīng)過重新組裝產(chǎn)生了大約271,000個(gè)拼接序列（contigs）和9,700,000個(gè)單一序列的reads（singletons）,。通過NCBI網(wǎng)站上的核苷酸BLAST分析確定其中的10,623個(gè)contigs和4,900,000個(gè)singletons屬于細(xì)菌類,。同時(shí)通過對(duì)含有Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的對(duì)照組CSF樣品進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)生了65個(gè)reads,，其中29個(gè)屬于脊髓灰質(zhì)炎病毒,，基因組覆蓋率達(dá)60.7%。在已經(jīng)通過PCR和Sanger測(cè)序法分別在AFM-07和non-AFM-16樣品中鑒定出EV-A71和E-25的情況下,，作者接著使用VirCapSeq-VERT測(cè)序再次對(duì)這兩個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè),，結(jié)果并沒有在腦脊液樣品中檢測(cè)到除腸病毒以外其他病毒的reads。對(duì)于AFM-07和non-AFM-16這兩個(gè)樣品,，本研究使用VirCapSeq-VERT測(cè)序法分別測(cè)出了16,994個(gè),，58,206個(gè)腸病毒reads，與腸病毒的基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn),，基因覆蓋率達(dá)99.0%和74.8%,。作者通過空位-填充PCR和5’端、3’端不翻譯區(qū)域擴(kuò)大的方法實(shí)現(xiàn)病毒性基因組的完全復(fù)原,。腸病毒（EV）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR本研究對(duì)AFM-07和non-AFM-016兩個(gè)樣本的腦脊液樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,，分別得到大約每微升11,000和270個(gè)拷貝的腸病毒RNA。急性遲緩性脊髓炎-血清芯片（AFM-SeroChip-1）的制備和高密度肽微陣列分析本研究使用基于Roche Nimblegen平臺(tái)的可編程肽微陣列通過研究腦脊液和血清中的抗體來尋找中樞神經(jīng)系統(tǒng)被感染的間接證據(jù),。AFM- SeroChip-1這個(gè)芯片的設(shè)計(jì)包含160,000條獨(dú)特的12個(gè)氨基酸肽,，其中11個(gè)為重疊的氨基酸肽，這囊括了所有人類腸病毒（腸病毒種類EV-A,，EV-B,，EV-C，EV-D）的跨衣殼蛋白（VP1,，VP2,，VP3和VP4）及所有西尼羅河病毒（WNVs）的所有聚合蛋白,，使用的這些序列是在2019年1月31日從NCBI網(wǎng)站上下載得到的,。同時(shí)AFM- SeroChip-1也包括1,000個(gè)隨機(jī)12個(gè)氨基酸肽，從而檢測(cè)樣品中的非特異性結(jié)合,。本研究使用AFM- SeroChip-1芯片對(duì)實(shí)驗(yàn)組AFM中的14個(gè)腦脊液樣品和三個(gè)對(duì)照組（NAC,，KDC和AC）中的27個(gè)腦脊液樣品就腸病毒（EV）和西尼羅河病毒（WNVs）這兩種病毒進(jìn)行IgM和IgG抗體檢測(cè)。不過血清樣品只能檢測(cè)其中的一部分,。作者通過肽微陣列對(duì)AFM組14個(gè)患者和NAC組6個(gè)患者的腦脊液樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí),，發(fā)現(xiàn)了在美國(guó)出現(xiàn)過的8種蜱傳播的病原體，包括嗜吞噬細(xì)胞無形體（人粒細(xì)胞無形體?。?、微小巴貝蟲（巴貝蟲?。⒉鲜杪菪w（萊姆?。?、包柔氏螺旋體、查菲埃立克體（人單核細(xì)胞埃立克體?。?、立氏立克次體（落基山斑疹熱）、哈特蘭病毒和玻瓦桑病毒,。作者考慮到西尼羅河病毒和蜱傳播病原體都是群體性病原,，可能會(huì)牽涉其中，因此也對(duì)它們進(jìn)行了抗體研究,。腸病毒（EV-A,，EV-B，EV-C和EV-D）VP1衣殼蛋白保守肽的免疫反應(yīng)性檢測(cè)本研究采用高密度肽微陣列技術(shù)檢測(cè)腸病毒衣殼蛋白組的免疫反應(yīng)性,。作者在腸病毒（EV-A,，EV-B，EV-C和EV-D）VP1衣殼蛋白中確定了一個(gè)18個(gè)氨基酸區(qū)域（這個(gè)氨基酸區(qū)域包含來自每一種腸病毒7個(gè)重疊的12氨基酸肽）（圖1）,，它與來自急性遲緩性脊髓炎患者的血清樣品和腦脊液樣品（圖2）發(fā)生免疫反應(yīng),。這個(gè)區(qū)域在腸病毒物種中高度保守，通常用于推斷廣泛的腸病毒免疫反應(yīng)性,。它可以總結(jié)為一個(gè)模型PALXAXETG,，而在EV-D中，這個(gè)模型中的PAL被PSL代替（圖1）,。針對(duì)這一保守肽區(qū)域,，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腦脊液樣品進(jìn)行免疫反應(yīng)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AFM組中有79%腦脊液樣品呈陽性,，而三個(gè)對(duì)照組NAC,、KDC和AC中分別有79%、0%和11%呈現(xiàn)陽性（P=0.023,0.0001和0.0028）
圖1. 從NCBI網(wǎng)站下載的EV-A, EV-B,，EV-C和EV-D參考序列中有免疫反應(yīng)活性的VP1蛋白保守肽的基酸序列
圖2. 實(shí)驗(yàn)組AFM及三個(gè)對(duì)照組NAC,，KDC和AC腦脊液樣品的VP1保守肽序列的免疫反應(yīng)活性檢測(cè)
研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組NAC中一個(gè)來自被E-25感染患有急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液樣品也對(duì)這一個(gè)腸病毒保守肽區(qū)域產(chǎn)生了免疫反應(yīng)。同時(shí)也在11名AC患者中的2個(gè)腦脊液樣品中發(fā)現(xiàn)了腸病毒肽的抗體,，其中,，這2個(gè)腦脊液樣品來自2位重癥監(jiān)護(hù)病人，他們患有不同的非急性遲緩性脊髓炎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病,。這兩個(gè)成人患者中的一個(gè)患有先天性癲癇,，另一個(gè)患有多發(fā)性硬化癥。對(duì)照組KDC組中的腦脊液樣品中并沒有發(fā)現(xiàn)任何腸病毒肽的免疫反應(yīng)（圖2）,。而在AFM實(shí)驗(yàn)組或非AFM病人的腦脊液樣品中,，也沒有發(fā)現(xiàn)西尼羅河病毒或蜱傳播病原體的抗體,。作者在所有的血清樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，大約有90%樣品對(duì)腸病毒的VP1保守肽序列產(chǎn)生了免疫反應(yīng)（實(shí)驗(yàn)組AFM,、對(duì)照組NAC,，KDC和AC分別對(duì)應(yīng)100%、100%,、75%和100%）,。急性遲緩性脊髓炎患者對(duì)應(yīng)腸病毒EV-D68特異性VP1保守肽的免疫反應(yīng)性盡管實(shí)驗(yàn)組AFM和對(duì)照組的血清樣品中有70%的樣品至少對(duì)一種腸病毒EV-D的VP1保守肽具有免疫反應(yīng)性，作者仍在腸病毒EV-D68 VP1蛋白的羧基端鑒定出一個(gè)含有22個(gè)氨基酸的線性肽序列,，這個(gè)序列只對(duì)實(shí)驗(yàn)組AFM患者的樣品具有免疫反應(yīng)性,。在患有急性遲緩性脊髓炎的患者中，這個(gè)線性保守肽對(duì)43%的腦脊液樣品和73%的血清樣品具有免疫反應(yīng)（圖3）,。相比之下,，這個(gè)肽對(duì)于對(duì)照組的5個(gè)NAC患者、10個(gè)KDC患者或11個(gè)AC患者的腦脊液或血清樣品均無免疫性,。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,，與三個(gè)對(duì)照組NAC、KDC和AC樣品相比,，實(shí)驗(yàn)組AFM的腦脊液樣品（P=0.008,，0.0003和0.035）和血清樣品（P=0.135，0.002和0.009）均有差異,。
圖3.實(shí)驗(yàn)組AFM及三個(gè)對(duì)照組NAC,，KDC和AC樣品的EV-D68特異性22個(gè)氨基酸的VP1衣殼蛋白肽的免疫反應(yīng)活性檢測(cè)
自2014年夏季起，美國(guó)確診了超過560例急性遲緩性脊髓炎患者,。大多數(shù)急性遲緩性脊髓炎病因的不確定性造成了重要的公共衛(wèi)生干預(yù)措施的缺失,，比如制定具體的診斷、治療和預(yù)防措施,。越來越多的研究證據(jù)表明,，腸病毒包括EV-D68和EV-A71，可能與急性遲緩性脊髓炎有關(guān),。急性遲緩性脊髓炎與腸病毒EV-D68和EV-A71存在潛在聯(lián)系的提出是基于以下三點(diǎn)：1.病毒RNA出現(xiàn)在患者的呼吸道和糞便樣品中,；2.研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染EV-D68會(huì)導(dǎo)致脊髓損傷,、壞死和癱瘓,；3.急性遲緩性脊髓炎的爆發(fā)與EV-D68引起呼吸道疾病的爆發(fā)具有時(shí)間相關(guān)性。然而,，在AFM患者的腦脊液中卻很少檢測(cè)到腸病毒（美國(guó)疾病預(yù)防控制中心研究發(fā)現(xiàn)567例確診的AFM患者中僅4例可以檢測(cè)到腸病毒）。考慮到腸病毒與AFM的潛在聯(lián)系,，以及無法直接在腦脊液中檢測(cè)其核苷酸這些因素,，研究者通過檢測(cè)腦脊液中腸病毒的特異性抗體來間接尋找患者感染腸病毒的證據(jù),。腸病毒感染在兒童中比較常見，但傳統(tǒng)的免疫分析方法比如酶聯(lián)免疫共沉淀（ELISA）由于交叉反應(yīng)的原因,，并不能有效的檢測(cè)到腸病毒,。病毒中和試驗(yàn)雖然被認(rèn)為是檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對(duì)于超過100種腸病毒這種大量的密集檢測(cè),，進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)并不現(xiàn)實(shí),。因此，本研究采用的微陣列系統(tǒng),，可以高分辨率地同時(shí)篩選上千個(gè)所有已知的人類腸病毒多肽,。整個(gè)腸病毒衣殼蛋白是由160,000個(gè)肽段拼接而成，其中,，保守的腸病毒VP1衣殼蛋白肽段對(duì)79%患有AFM的兒童腦脊液樣品具有免疫反應(yīng),，然而這些樣品大部分卻檢測(cè)不到腸病毒RNA。相比之下,，對(duì)照組NAC患者的任何樣品都檢測(cè)不到腸病毒RNA,，KDC患者在腦脊液樣品中也沒有檢測(cè)到腸病毒肽的抗體。這個(gè)保守肽區(qū)域反映出廣泛的腸病毒免疫反應(yīng)活性,，表明腸病毒感染與急性遲緩性脊髓炎有關(guān),。這個(gè)結(jié)果也與小鼠模型感染腸病毒的發(fā)病機(jī)制一致，包括EV-D68在內(nèi)的腸病毒可以導(dǎo)致小鼠癱瘓,。若通過比較腦脊液與血清中腸病毒肽含量的比值就證明腸病毒抗體是在脊髓鞘內(nèi)產(chǎn)生的,，這將為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供更有力的證據(jù)。本研究并不能同時(shí)收集到足量的腦脊液和血清樣品來分析排除腸病毒肽是從外周循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)這一可能性,。然而,，研究者認(rèn)為這一可能并不能解釋急性遲緩性脊髓炎患者腦脊液中腸病毒肽抗體的出現(xiàn)。在對(duì)照組16個(gè)病人（3個(gè)NAC,，8個(gè)KDC和5個(gè)AC患者）的血清樣品中檢測(cè)到腸病毒肽抗體,，其中只有2個(gè)成年患者和1個(gè)兒童患者的腦脊液中也檢測(cè)到腸病毒肽抗體。在腦脊液中檢測(cè)到腸病毒肽抗體的兒童存在著顯著的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病,，并且在其腦脊液樣品中檢測(cè)到了E-25,。2個(gè)成年中的一個(gè)患有多發(fā)性硬化癥，另一個(gè)先天性癲癇,。此外,，在印度戈勒克布爾的一項(xiàng)關(guān)于不明原因腦炎的研究中也使用了相同的肽段微陣列平臺(tái)，他們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)77個(gè)兒童中僅有3個(gè)兒童的血清和腦脊液中同時(shí)存在腸病毒肽抗體,。這3個(gè)兒童中的2個(gè)兒童根據(jù)癥狀和腦脊液中檢測(cè)到腸病毒RNA（柯薩奇病毒或艾柯病毒）被診斷為腸病毒腦膜炎（來自N. Mishra 和 W. I. Lipkin的未發(fā)表數(shù)據(jù)）,。本研究證明了腸病毒EV-D68特異性肽段（位于VP1衣殼蛋白的C末端）對(duì)實(shí)驗(yàn)組AFM患者腦脊液樣品中49%都具有免疫反應(yīng)活性，而對(duì)三個(gè)對(duì)照組NAC、KDC和AC患者的腦脊液樣品中沒有任何免疫活性,。基于結(jié)構(gòu)同源性分析,，研究者預(yù)測(cè)腸病毒EV-D68菌株的VP1衣殼蛋白C末端會(huì)形成病毒中和免疫原和假定中和抗體的構(gòu)象表位。因此,，有73%AFM患者的血清對(duì)腸病毒EV-D68特異性肽段具有免疫活性,，相比之下，對(duì)照組并沒有免疫活性,。作者的這些發(fā)現(xiàn)可能與美國(guó)AFM兒童與成年患者的血清陽性率研究不一致,，他們使用病毒中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)患者的血清幾乎為100%的陽性率。這種差異的可能原因是,，病毒中和試驗(yàn)可能會(huì)檢測(cè)到其他非線性構(gòu)象表位,，而本研究的肽微陣列分析只能檢測(cè)線性表位。作者認(rèn)為檢測(cè)一個(gè)肽段區(qū)域的活性無法與使用全病毒粒子進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)相比較,。感染塞卡病毒的兒童血清檢測(cè)的一個(gè)研究中,，研究者發(fā)現(xiàn)NS2B蛋白抗體是特異性存在的，但有45%患者在剛確診感染后6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)不到的NS2B蛋白抗體,。本文作者認(rèn)為搞清楚EV-D68特異性肽對(duì)AFM患者具有高免疫活性,，對(duì)照組卻沒有的原因，就可以闡明EV-D68的免疫反應(yīng)原理了,。作者的血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)支持了進(jìn)一步探究急性遲緩性脊髓炎與腸病毒（包括EV-D68）之間的相關(guān)性,。對(duì)于大多數(shù)急性遲緩性脊髓炎患者，病毒感染通常發(fā)生在其比較虛弱的前幾天,，這與患者呼吸道疾病出現(xiàn)的時(shí)間比較相符,。本研究沒有在AFM患者腦脊液中檢測(cè)到EV-D68的RNA，這可能說明沒有病毒從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軟組織進(jìn)入到脊髓腔內(nèi),。當(dāng)然,，也可能是腦脊液樣品是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)清除病毒后采集到的。本研究的一個(gè)重要不足之處是相對(duì)于實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)收集的年齡,、年份或季節(jié),，對(duì)照組的設(shè)置并不是最佳。盡管本研究者通過設(shè)置三對(duì)照組來檢測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的特異性,，但前瞻性的研究需要從相同的腸病毒爆發(fā)季節(jié)中設(shè)置合適的對(duì)照,，這對(duì)檢測(cè)研究的正確性十分重要。在AFM的其他病因還在研究時(shí),，本研究進(jìn)一步證明了腸病毒感染可能是患AFM的一個(gè)原因,。在不能直接檢測(cè)病原體的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在病原體的抗體是患AFM潛在的一個(gè)重要指標(biāo),。本文的研究結(jié)果值得進(jìn)一步的研究,，包括檢測(cè)更多的樣品,、確診分析和設(shè)計(jì)最優(yōu)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。但是,，本研究這些最初的研究結(jié)果為進(jìn)一步探索腸病毒是如何引起AFM的,，以及AFM的確診和治療提供了線索和途徑,。雖然麻痹性疾?。ㄈ缧郝楸裕┈F(xiàn)在已經(jīng)得到比較好的控制，但這類疾病的發(fā)病機(jī)理并不是十分明確?，F(xiàn)在仍有一些麻痹綜合征類的疾病無法得到控制,，如急性遲緩性脊髓炎（AFM）。本文通過采用VirCapSeq-VERT技術(shù)及肽微陣列分析的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品進(jìn)行分析,，進(jìn)一步證明了腸病毒感染是患AFM的一個(gè)原因,，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了在腸病毒VP1衣殼蛋白羧基端的一個(gè)新的線性保守肽，這為AFM的診斷和治療提供了新的思路,，對(duì)于AFM的機(jī)理研究具有重要意義,。
|
