【原】心衰伴心室輔助裝置患兒循環(huán)miRNA變化的初步研究

非編碼研究園地 2021-02-01

展開全文

論文：Variations of circulating miRNA in paediatric patients with Heart Failure supported with Ventricular Assist Device: a pilot study（心衰伴心室輔助裝置患兒循環(huán)miRNA變化的初步研究）

摘要

循環(huán)miRNAs(c-miRNAs)是HF診斷和預(yù)后的有希望的生物標志物.目前還沒有關(guān)于心衰患兒接受VAD植入術(shù)的研究。本研究的目的是：檢查高頻兒童的c-miRNAs譜,；評價vad對c-miRNAs水平的影響,；離體驗證推測的c-miRNA靶點。

應(yīng)用神經(jīng)生長抑素(NGS)法測定心衰患兒VAD植入前后血清C-miRNA譜.在VAD植入前,、4小時,、1、3,、7,、14、30天,，用實時PCR方法檢測c-miRNA的差異表達.通過miRNA模擬轉(zhuǎn)染HepG 2細胞的研究,，驗證了miRWalk數(shù)據(jù)庫篩選的miRNA靶點。

在VAD植入后30天,，對13個c-miRNAs進行修飾,，與NSG的VAD前比較，其中6個c-miRNAs經(jīng)Real-TimePCR證實,。被證實的c-miRNAs的靶基因參與了止血過程.這個離體研究證實hsa-miR-409-3p對凝血因子7(F7)和F2有下調(diào)作用,。

值得注意的是，所有患者都有需要泵改變的血栓事件,?？傊贖F兒童中,，VAD治療30天后,，參與調(diào)節(jié)止血事件的6種c-miRNAs的水平發(fā)生了變化。特別是c-miR-409-3p調(diào)節(jié)F7和F2的降低,，可反映VAD植入后的血栓形成狀態(tài)。

結(jié)果

實驗設(shè)計在臨床環(huán)境中,，在VAD植入后1個月之前和期間,，從HF兒童(n=5，研究樣本)中采集血清樣本(1),。為鑒定VAD治療修飾的c-miRNA,，從VAD治療前和治療后1個月的血清標本中分離出c-miRNA，用下一代測序(NGS)(2,，發(fā)現(xiàn)階段)進行c-miRNA譜分析,，經(jīng)精細統(tǒng)計分析后，用實時PCR(3,，驗證階段)對測序結(jié)果進行驗證,。

結(jié)果經(jīng)臨床推廣,，在VAD植入后1個月內(nèi)不同時間點采集的血清標本進行實時PCR檢測(4)，并與VAD植入后1個月內(nèi)發(fā)生的不良事件相關(guān)(5),。

最后,，為了預(yù)測選定的c-miRNAs的靶區(qū)，硅中使用基因本體和miRWalk軟件進行分析(6),，并對已識別和臨床選擇的目標進行了驗證,。離體特異性miRNA-模擬物轉(zhuǎn)染HepG 2細胞的研究(7)。

C-miRNAs譜

應(yīng)用NGS技術(shù)獲取一組小兒HF患者血清miRNAs譜(N=5,，補充表),。VAD植入后1個月?？偟膩碚f,，平均每個樣本中有340個c-miRNAs，所有樣本中都有169個,。C-miRNAs圖譜的層次聚類分析,。

顯示，在全球范圍內(nèi),，他們并沒有在VAD前后的樣本中分組.然而,，與VAD后相比，VAD前血清中共有13例c-miRNAs有差異(adj-p<0.1).其中9例c-miRNAs表達下調(diào),，4例c-miRNAs表達上調(diào),。差異表達的c-miRNAs的詳細列表載于補充表。

測序數(shù)據(jù)的實時PCR驗證

為了驗證測序結(jié)果,，我們還用實時PCR對13種c-miRNAs進行了定量分析.其中6個c-miRNAs的差異表達譜與NGS實驗結(jié)果一致.具體來說,，hsa-miR-483-3p，hsa-miR-409-3p和hsa-miR-485-3p在VAD治療1個月后下降到無法檢測到的水平,。

植入VAD后,，HSA-miR-432-5p呈下降趨勢，hsa-miR-150-3p和hsa-miR-375呈上升趨勢(圖1),。選擇這6種miRNAs進行下游分析,。

C-miRNA識別靶區(qū)的實驗驗證

由于F_2、F_5,、F_7,、F_8、F_9和proc在肝臟中均有表達,，因此,，采用miRNA模擬轉(zhuǎn)染技術(shù)，以HepG 2細胞為研究對象,，對所選c-miRNA的靶點進行了鑒定,。

轉(zhuǎn)染hsa-miR-409-3p模擬物后48h細胞中F7的表達水平明顯低于單純轉(zhuǎn)染miRNA(miR-CT)模擬或脂質(zhì)體的細胞(見圖),。此外，轉(zhuǎn)染hsa-miR-409-3p后,，F(xiàn)2的表達水平與單純脂質(zhì)體處理的對照組相比明顯降低(見圖),。這些結(jié)果證實hsa-miR-409-3p在HepG 2中對f7和f2的調(diào)節(jié)作用。