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在這里,，作為生物醫(yī)學的你，想要的這里都能滿足,！ 免疫組織化學（簡稱免疫組化）是組織化學的一種,，它是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點,，通過化學反應(yīng)使標記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶,、金屬離子,、同位素等，顯示一定的顏色,，并借助顯微鏡觀察其顏色的變化,，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細胞結(jié)構(gòu)的化學成份或化學性質(zhì),。 實驗過程包括切片制作（固定,，脫水，透明,，包埋,，切片，貼片,，烤片）,，脫蠟，水化,，阻斷,，抗原修復(fù)，封閉,，一抗孵育,，二抗孵育，顯色,，復(fù)染,，封片，分析,。 實驗過程常見問題如檢測結(jié)果陰性,，非特異性染色，染色強度不夠,，著色不均,，脫片，干片等,。一起來看案例解析,，助您高效做出準確實驗結(jié)果。  常見問題： 組織固定不及時或不完全固定,HE染色細胞核發(fā)灰模糊,，對比不鮮明,；免疫組化染色結(jié)果不理想，通常組織離體2h后抗原完全丟失。    檢測組織：人淋巴結(jié)組織石蠟切片 檢測：CD45染色 問題：組織固定不充分,，淋巴結(jié)邊緣淋巴細胞CD45染色強陽性,，組織內(nèi)部淋巴細胞CD45染色弱陽性，染色不均,。   檢測組織：腎臟組織石蠟切片 檢測：HE染色 問題：固定不及時或固定不完全,，細胞核模糊，對比不鮮明,。 建議： 1,、組織離體后盡快固定，組織塊大小為15×15×5mm,，切開固定效果好,； 2、固定液以10％中性福爾馬林緩沖液為佳,； 3,、固定時間在4h-24h之間，長時間固定會影響抗原決定簇的暴露,，產(chǎn)生陰性結(jié)果,； 4、固定液的量要超過組織體積5倍以上,。 常見問題： 如果組織脫水,、浸蠟不充分,，蠟塊會出現(xiàn)組織收縮凹陷，而且在免疫組化熱抗原修復(fù)操作時會容易脫片,。 建議： 1 梯度酒精脫水盡量徹底充分,； 2 二甲苯透明時間不宜長，1～3h為佳,，透明過度會導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆,； 3 浸蠟應(yīng)選擇低熔點的石蠟，浸蠟應(yīng)充分,。 常見問題： 切片太厚,，有刀痕，有褶皺,，脫片,。 問題： 有刀痕，影響結(jié)果的判讀。 左：乳腺癌組織石蠟切片,，Mammaglobin染色陽性,，脫片，烤片時間不足,。 右,，乳腺癌組織石蠟切片，MUC6染色陰性,，烤片時間充分,。 建議： 1 切片厚度視組織而定，如同淋巴結(jié),、腎等需要比較?。ú怀^3um），腦組織需要較厚（尤其是取新鮮標本冰凍制片時）,，常規(guī)都要6-8um最佳,，冰凍可切至10um；其他一般如胃腸道,、肝膽等等組織,，2-4um均可,太厚易掉片，細胞重疊,，影響觀察,。切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異,；新刀片容易切出完好的切片,。 2 撈片要求達到無皺折、無氣泡,，水溫宜在40℃左右,。 3 粘片時需準備蛋白甘油，蛋白甘油由雞蛋蛋清和甘油調(diào)配而成,，比例為1：1,。?先將一滴蛋白甘油涂抹在干凈的載玻片上，然后用載玻片從水中將展好的蠟片撈起,，平放入烘箱內(nèi)進行烘干,。或者玻片用防脫片或多聚賴氨酸處理,，以增強粘附性,。 4 烘干溫度為50℃，時間為12～24h,。 常見問題: 脫蠟不全,組織出現(xiàn)異染現(xiàn)象,異染現(xiàn)象一般是蘇木素著色不佳,HE染色沒有選擇性,染色不均勻,。有的是伊紅染不上。 建議： 根據(jù)不同的室溫，調(diào)節(jié)脫蠟的時間,，原則上是要徹底,、干凈、完全地脫去切片上的蠟,。 抗原修復(fù)是免疫組化中不可忽略的關(guān)鍵步驟,。原因是組織經(jīng)福爾馬林等固定液固定和石蠟包埋后，抗原決定簇與核酸易發(fā)生交聯(lián),，引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變,，導(dǎo)致抗原決定簇被封閉，是抗原與抗體結(jié)合點減少,，從而令抗原抗原的陽性檢測率及著色強度相對減弱,。這種交聯(lián)在高溫加熱或是蛋白酶水解作用下會發(fā)生可逆反應(yīng)，恢復(fù)蛋白的原有構(gòu)象,，這一過程就是抗原修復(fù),。 常見問題： 陽性檢測率及著色強度相對減弱。 不同組織,，不同PH值抗原修復(fù)液其染色結(jié)果強度不一樣,。有些抗原隨抗原修復(fù)液PH值的變化，其染色強度沒有明顯變化（A型）,；有些抗原隨抗原修復(fù)液PH值的升高,，其染色強度降低后又升高（B型），有些抗原隨抗原修復(fù)液PH值升高,，其染色強度升高（C型）,。 相同組織，不同PH值抗原修復(fù)液其結(jié)果染色強度不一樣,。 1 抗原修復(fù)緩沖液有多種,，常用的則為檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），EDTA緩沖液（pH8.0-9.0）,，Tris/Tris-EDTA緩沖液（pH9.0-10.0）,，或者胰酶法（pH3.5±0.2）； 2 修復(fù)液的不同PH值對染色結(jié)果的影響比較大,； 3 沒有一種抗原修復(fù)緩沖液可以適用于所有抗原,； 4 大部分抗原在修復(fù)液pH8.0-9.0的范圍值可以獲得一個普遍較好的修復(fù)效果，所以堿性緩沖液應(yīng)用普遍些,。 注意事項： 1 根據(jù)二抗系統(tǒng)中是否含有生物素而選擇封閉劑,。 2 無生物素的二抗系統(tǒng)可以不使用封閉劑，如Immunoway的RS0011通用型二抗,。 3 卵白素類的二抗系統(tǒng)需要根據(jù)生物素的種類選擇相應(yīng)的封閉劑在一抗前處理組織切片。 4 封閉時間過長，會導(dǎo)致陽性信號減弱甚至出現(xiàn)假陰性,。 5 封閉時間不足,，會導(dǎo)致背景增強甚至出現(xiàn)假陽性。 檢測組織：人結(jié)腸癌石蠟組織切片 檢測：CEA染色 問題：染色液的堆積（黑色箭頭區(qū)域） 建議：充分洗滌,。 檢測組織：人前列腺石蠟組織切片 檢測：TIMP-1染色 問題：干片導(dǎo)致的假陰性（黑色箭頭區(qū)域） 建議：加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止切片干燥,。 檢測組織：人扁桃體石蠟組織切片 檢測：Lysozyme染色 問題：邊緣效應(yīng)造成的非特異性染色（黑色箭頭區(qū)域） 建議：組織切片與玻片黏貼牢固，試劑完全覆蓋組織防止干片,，加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止邊緣效應(yīng),。 免疫組化耗時長，步驟繁多,，為了得到特異性染色,，獲得可靠結(jié)論，選擇合適的一抗十分關(guān)鍵,?；驹瓌t是選擇選擇特異性強，靈敏度高,，背景低的抗體,，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)再現(xiàn)性良好的抗體,。 抗體的特異性體現(xiàn)在組織特異性,，細胞特異性，細胞亞定位的特異性,。 檢測組織：人前列腺癌石蠟組織切片 檢測：不同PSAP抗體染色 左：癌細胞胞漿強陽性,，抗體細胞特異性及細胞亞定位染色正確。 右,，癌細胞胞膜弱陽性,，抗體細胞特異性正確，細胞亞定位錯誤,，該抗體特異性不準確,。 檢測組織：人前列腺石蠟組織切片 檢測：不同PR抗體染色 左：前列腺細胞胞核強陽性，抗體出現(xiàn)非特異性染色,，抗體特異性不準確,。 右：前列腺組織染色結(jié)果為陰性，抗體未出現(xiàn)非特異性染色,。 建議： 抗體的特異性是選擇抗體最重要的原則,，不同抗體特異性不同，組織特異性,，細胞特異性,，細胞亞定位的特異性需都準確,。 檢測組織：人乳腺癌石蠟組織切片 檢測：不同HER2抗體染色 左：癌細胞染色胞膜強陽性。 右：癌細胞染色胞膜弱陽性,，抗體染色強度不夠,。 問題： 檢測結(jié)果會出現(xiàn)弱陽性。 建議： 適當調(diào)整抗體稀釋比,，或者選擇染色強度高,，高親和力的抗體。 如染色結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色或者是低背景,，可以通過調(diào)整抗體的稀釋比進行改善,，特異性強的抗體則不易受稀釋比的影響。 檢測組織：人肝臟石蠟組織切片 檢測：EMA染色 左：抗體1:8000稀釋,，略有背景,。 右：調(diào)整抗體稀釋比例1：30000，背景情況有所改善,，抗原染色強度也有所降低,。 建議：當結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色或者有背景時，可以適當調(diào)整一抗的稀釋比例進行改善,。 檢測組織：人膀胱石蠟組織切片 檢測：CK20染色 左：抗體1:2000稀釋,，膀胱傘細胞胞漿陽性，背景干凈,。 右：抗體1:4000稀釋,，膀胱傘細胞胞漿陽性，背景干凈,。 檢測組織：人甲狀腺乳頭狀腺癌石蠟組織切片 檢測：TGB染色 左：抗體1:5000稀釋,，癌細胞胞漿陽性，背景干凈,。 右：抗體1:4000稀釋,，癌細胞胞漿陽性，背景干凈,。 結(jié)論： 特異性強的抗體檢測結(jié)果不易受稀釋比例的影響,。 檢測組織：人結(jié)腸癌石蠟組織切片 檢測：CEA染色 左：一抗4°C過夜，癌細胞胞漿強陽性,，背景干凈,。 右：一抗37°C-60min，癌細胞胞漿中等強度陽性,，背景干凈,。 結(jié)論： 孵育條件對染色結(jié)果略有影響，需篩選合適的孵育條件,。 問題： 染色結(jié)果與預(yù)期不符,，檢測陰性或者弱陽性,。 建議： 設(shè)置陽性組織切片的對照，因為同一蛋白在不同組織中的表達會有很大的差異,。 使用不同顯色系統(tǒng),，可以呈現(xiàn)不一樣的顯色效果。 左：HRP直標二抗顯色系統(tǒng),。 右：多聚物酶標記二抗顯色系統(tǒng)。 檢測組織：人闌尾組織石蠟組織切片 檢測：Cytokeratin 19染色 左：二抗為HRP直標二抗顯色,，染色結(jié)果弱陽性,，低背景。 右：多聚物酶標記二抗顯色,，染色結(jié)果強陽性,，背景干凈，對比明顯,。 檢測組織：人胎盤組織石蠟組織切片 檢測：CD34染色 左：二抗為HRP直標二抗顯色,，染色結(jié)果弱陽性，低背景,。 右：多聚物酶標記二抗顯色,，染色結(jié)果強陽性，背景干凈,，對比明顯,。 結(jié)論： 不同的顯色系統(tǒng)會有不一樣的顯色結(jié)果。多聚物酶標記二抗比普通的HRP直標二抗靈敏度更高,，背景更干凈,，對比更明顯。 問題： 產(chǎn)生深棕至黑色的DAB絮狀或團狀沉積于組織切片上,。 建議： 1 現(xiàn)配現(xiàn)用：因為DAB顯色液配置好了之后極容易產(chǎn)生DAB的沉積,，從而導(dǎo)致樣本上會出現(xiàn)深棕色的絮狀沉淀，干擾結(jié)果的判定,。 2 顯色時間：所有說明書上的顯色時間均為一個范圍,，有的反應(yīng)迅速的30s-3min，有的反應(yīng)緩慢的3-20min,，應(yīng)該靈活調(diào)整,，最好是滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時間。 問題： 信號偏弱 建議： 適當延長顯色時間,，滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時間,。 1.不同的蘇木素配方的染色時間各有不同，配置的新舊程度染色時間也不同,。 2.國際上常用的為Harris蘇木素,，因為配方中含汞,，通常還需要進行分化，返藍的步驟,，但顏色亮麗,。 3.改良的Mayer蘇木素配方不需要分化，時間可以根據(jù)配置的時間調(diào)整染色時間15s-2min,。 以上分享愿有所幫助,，祝您實驗順利！ 感謝您的關(guān)注,，祝您科研順利,！ 5.GraphPadPrism 8.0體驗一個月后的分享,！ 6.如何正確的獲取和整理大量的實驗數(shù)據(jù),？ 7.生物醫(yī)藥全國高校聯(lián)盟信息交流互助群歡迎加入 10.Western blot 實驗技術(shù)及常見問題分析 |
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