四川大學生物材料工程研究中心的研究團隊在Acta Biomaterialia雜志上發(fā)表了題為“Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics”的文章，揭示了磷酸鈣陶瓷的骨誘導與巨噬細胞極化之間的關聯(lián),。這些結(jié)果不僅加深了人們對骨誘導機制的了解,，也有助于設計新型的骨誘導支架。生物材料工程研究中心的肖玉梅和梁潔為共同通訊作者,。

研究背景

如今,，生物材料的固有骨誘導已經(jīng)被廣泛接受。例如,，磷酸鈣（CaP）陶瓷可以在沒有外源細胞和生長因子的非骨部位誘導異位成骨。盡管這種骨誘導作用具有巨大的臨床潛力,，但其內(nèi)在機制還沒有完全弄清,。

骨免疫學領域的研究表明，免疫細胞在維持骨穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)骨重建中起著至關重要的作用,。有證據(jù)表明,，免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)共享許多調(diào)控分子，包括細胞因子,、趨化因子,、受體和轉(zhuǎn)錄因子。生物材料在植入后會不可避免地引發(fā)宿主反應,，且炎癥程度會影響植入物的性能,，特別是骨誘導性。

巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)的第一道防線,，在此過程中發(fā)揮重要的作用,。它不僅具有吞噬作用，還可以分泌趨化因子和細胞因子來調(diào)節(jié)炎癥程度,。此外,，巨噬細胞表現(xiàn)出明顯的可塑性，可根據(jù)環(huán)境變化而顯示出一系列不同功能的極化表型,。M1型和M2型是目前廣泛研究的兩種表型,，分別具有促進炎癥以及減輕炎癥和促進細胞修復的作用。

先前有研究表明,，骨科材料會影響巨噬細胞的極化,。基于此,，研究人員利用小鼠肌內(nèi)植入模型和三種常用的磷酸鈣陶瓷材料,，以證明巨噬細胞極化在材料誘導的骨形成中起著關鍵作用。

三種CaP陶瓷的骨誘導作用

在這項研究中,，研究人員選擇了三種多孔結(jié)構(gòu)的磷酸鈣陶瓷,，包括羥基磷灰石（HA）,、雙相磷酸鈣（BCP）和β-磷酸三鈣（β-TCP）。他們通過手術將多孔CaP圓柱體植入BALB/C小鼠肌肉內(nèi),，并在90天后評估CaP陶瓷的骨誘導作用,。少數(shù)HA樣本（2/7）和多數(shù)BCP樣本（6/7）中觀察到異位骨形成。然而,，β-TCP樣本中未觀察到骨形成,，其孔內(nèi)充滿了纖維狀和脂肪樣組織。

為了評估免疫細胞浸潤,，研究人員在植入后第7,、14和21天提取樣本，并通過HE和免疫熒光染色觀察,。隨著植入時間的延長,，大量細胞（尤其是F4/80+ 巨噬細胞）從CaP陶瓷的表層區(qū)域（區(qū)域1）遷移到內(nèi)部區(qū)域（區(qū)域3）。不過,，BCP組的F4/80+ 巨噬細胞數(shù)量隨時間急劇減少,，而β-TCP組中巨噬細胞的數(shù)量逐漸增加。

體內(nèi)分析CaP陶瓷誘導的巨噬細胞極化

研究人員首先對組織切片進行免疫熒光染色,，以研究體內(nèi)巨噬細胞極化,。在植入初期（第7、14和21天）,，β-TCP組的iNOS+ M1型巨噬細胞比例最高,，而BCP組的ARG+ M2型巨噬細胞比例最高。對于β-TCP組,，他們發(fā)現(xiàn)M1/M2比例逐漸增加,，且M1型巨噬細胞數(shù)量更多，而BCP組在第7,、14和21天都有更多的M2型巨噬細胞,。

圖1. 在植入后對M1和M2表型標志物進行免疫熒光染色

之后，他們又利用RT-qPCR技術評估了M1型標志物（iNos）和M2型標志物（Arg）的基因表達,。在第7天,，BCP組的iNos和Arg mRNA表達量最低，不過到了第21天,，BCP組明顯上調(diào)了Arg基因表達,，并下調(diào)了iNos基因表達。這些結(jié)果表明,，骨誘導能力出色的BCP陶瓷能夠誘導M2型巨噬細胞極化,。相反，沒有明顯骨誘導性的β-TCP陶瓷促進了iNOS+ M1型巨噬細胞。

體外分析CaP陶瓷調(diào)控的巨噬細胞行為

為了深入了解其免疫調(diào)節(jié)特性,，研究人員又在體外研究了CaP陶瓷對巨噬細胞行為的影響,。他們利用掃描電鏡觀察了在三種CaP陶瓷上生長的巨噬細胞的形態(tài)。電鏡圖像表明,，HA和BCP上的大多數(shù)巨噬細胞開始伸長,，呈紡錘狀，而β-TCP上的大多數(shù)巨噬細胞保持球狀或橢圓狀,。這些結(jié)果表明,，β-TCP陶瓷抑制了巨噬細胞的擴散和伸長。

他們還利用RT-qPCR 分析和多重免疫檢測定量了炎癥相關細胞因子和趨化因子的表達,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，β-TCP明顯上調(diào)了M1表型標志物的表達，促進巨噬細胞分泌IL-1β,、MCP-1,、MIP-1α和MIP-1β。相反,，BCP上調(diào)了M2表型標志物（Arg和Il10）的表達，并增加了CD206+ M2型巨噬細胞的比例,。這些結(jié)果與體內(nèi)研究一致,，表明β-TCP和BCP分別將巨噬細胞推向M1和M2表型，而HA對巨噬細胞極化沒有偏向,。

圖2. 炎性細胞因子和趨化因子的體外相對表達

此外,，研究人員還分析了巨噬細胞分泌因子對成骨的影響。他們利用來自巨噬細胞/CaP上清液的條件培養(yǎng)基來培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）,。結(jié)果表明,，與純培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基中鈣離子和磷離子的消耗降低了BMSC的增殖,。對于HA,、BCP和β-TCP組,，小鼠BMSC的增殖和成骨基因表達相當,。本研究中的BMSC由賽業(yè)生物提供。

總的來說,，這些結(jié)果表明,，骨科植入物的骨誘導能力與炎癥反應密切相關,，這是由植入物調(diào)控的巨噬細胞極化和功能狀態(tài)決定的。這項研究為了解生物材料的骨誘導機制奠定了基礎,。它也有望幫助人們設計出骨誘導支架的新策略,。