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高脂飲食會(huì)誘發(fā)肥胖,、胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良和脂肪變性,，而脂肪性肝炎向纖維化和肝細(xì)胞癌（HCC）的進(jìn)展主要與高膳食膽固醇有關(guān)。非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一類代謝疾病,，可從脂肪肝進(jìn)展至脂肪性肝炎,，進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC），膽固醇被認(rèn)為是疾病發(fā)展過程中主要的脂毒性分子,。

近日,，香港中文大學(xué)于君團(tuán)隊(duì)及其團(tuán)隊(duì)研究人員在《Gut》上發(fā)表了題為“Dietary cholesterol drives fatty liver- associated liver cancer by modulating gut microbiota and metabolites（膳食膽固醇通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)脂肪肝相關(guān)的肝癌，DOI:10.1136/gutjnl-2019-319664）”的研究論文,，闡述了膳食膽固醇在NAFLD–HCC發(fā)生中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制,。這項(xiàng)研究證明了長(zhǎng)時(shí)間的高膽固醇飲食可以引起小鼠自發(fā)性NAFLD-HCC（非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞癌）。抑制膽固醇可以恢復(fù)腸道微生物群,，完全阻止NAFLD-HCC的發(fā)展,。

背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，包括從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的一系列肝臟病理,。NASH可進(jìn)展為肝硬化、終末期肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC),。目前,，非酒精性脂肪肝是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和醫(yī)療負(fù)擔(dān)的主要原因。脂肪毒性會(huì)導(dǎo)致NASH,、纖維化/肝硬化,，甚至HCC。在肝臟脂質(zhì)種類中,，膽固醇被認(rèn)為是NASH發(fā)生過程中的主要脂毒分子,。肝臟是調(diào)節(jié)全身膽固醇穩(wěn)態(tài)的中心。膳食膽固醇對(duì)血漿和肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)有重要影響,。雖然膳食膽固醇在NASH進(jìn)展中的作用已被論述,，但長(zhǎng)期膽固醇治療在自發(fā)性和進(jìn)行性NAFLD-HCC發(fā)展的作用和致病基礎(chǔ)尚不清楚。一些研究表明,，腸道菌群是一個(gè)有助于NAFLD發(fā)生和其發(fā)展為NAFLD-HCC的環(huán)境因素,。微生物衍生的代謝物，如膽汁酸,、短鏈脂肪酸和三甲胺和它們影響的信號(hào)通路可能有助于NAFLD的發(fā)展,。特別是腸道菌群代謝產(chǎn)物3 -(4 -羥苯基)乳酸，對(duì)肝臟脂肪變性和肝纖維化具有共同的基因效應(yīng),。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

普通飼料（NC,，18%脂肪，58%碳水化合物,，24%蛋白質(zhì),，0%膽固醇）；高脂/低膽固醇飼料（HFLC，43.7%脂肪,，36.6%碳水化合物,，19.7%蛋白質(zhì)，0.013%膽固醇）,；高脂/高膽固醇飼料（HFHC,，43.7%脂肪，36.6%碳水化合物,，19.7%蛋白質(zhì),，0.203%膽固醇）

如圖所示，以上飼料用于隨機(jī)喂養(yǎng)8周齡雄性C57BL/6野生型同窩出生幼鼠14個(gè)月,。阿托伐他?。ń的懝檀妓帲┧幬锉挥糜谖故矵FHC膳食7個(gè)月后的小鼠，持續(xù)7個(gè)月,。然后分別在3,、8、10和12個(gè)月齡處死,。

糞移植實(shí)驗(yàn)：

取被喂養(yǎng)不同飼料的小鼠的1 g糞便樣品用5ml磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)混勻,，然后將該混懸液2 0 0μL灌胃移植給無菌小鼠。于移植后8,、10,、14個(gè)月各組中隨機(jī)抽取小鼠處死。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),，小鼠被禁食,，取血清/組織。記錄體重和內(nèi)臟脂肪重量,。肝臟被迅速切除并稱重,，評(píng)估表面結(jié)節(jié)的存在和大小。分離肝腫瘤,，在液氮中快速冷凍,，并將其保存在?80°C進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。腸道菌群分析采用16SrRNA測(cè)序,，血清代謝物分析采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)代謝組學(xué)分析,。

主要結(jié)果

1.   膳食膽固醇可自發(fā)驅(qū)動(dòng)NAFLD-HCC的發(fā)生,。

A）[endif]喂養(yǎng)HFHC飼料的小鼠在第3、8,、10,、12,、14個(gè)月檢測(cè)的血清AFP水平以及喂養(yǎng)NC和HFLC飼料的小鼠在第14個(gè)月檢測(cè)的血清AFP水平,。在第10個(gè)月觀察到AFP水平升高,，在第12個(gè)月和14個(gè)月，與HFLC或NC飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC飼料喂養(yǎng)的小鼠的AFP水平逐漸升高,。

B） [endif]肝臟MRI影像,。在第14個(gè)月時(shí)，喂養(yǎng)HFHC飼料的小鼠出現(xiàn)肝腫瘤,，而其余兩個(gè)沒有

C） [endif]依次為小鼠肝臟的大體形態(tài)、鏡下結(jié)構(gòu)以及Ki67染色的免疫組化圖像,。HFHC小鼠肝臟切片組織學(xué)檢查均為肝細(xì)胞癌,，平均每只小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞數(shù)為2.7±2.6，最大直徑為4.1±5.0 mm,。與HFLC喂養(yǎng)的小鼠相比,，HFHC喂養(yǎng)的小鼠肝臟切片中Ki-67陽性細(xì)胞明顯增多，表明HFHC喂養(yǎng)的小鼠細(xì)胞增殖增加,。

D） [endif]依次為體重,，內(nèi)臟脂肪，肝臟重量,，肝臟與體重的比率,。隨著肝癌的形成，喂養(yǎng)HFHC飼料的小鼠的這些指標(biāo)的水平顯著高于喂養(yǎng)NC飼料的小鼠,。同時(shí),，喂養(yǎng)HFLC飼料的小鼠也表現(xiàn)出這些指標(biāo)水平的上升。

E） [endif]依次為血清膽固醇,、肝游離膽固醇,、肝膽固醇酯含量、糖耐量試驗(yàn)及空腹胰島素水平,。與HFLC和NC相比,，HFHC小鼠的這些指標(biāo)的水平都有所上升。與NC相比,，HFLC小鼠的葡萄糖耐量和空腹胰島素也有所增加,。

2.   高膽固醇膳食喂養(yǎng)的小鼠的非肝癌肝組織形成了NASH和纖維化。

A）HE染色后的肝臟切片組織檢查,。HFHC小鼠出現(xiàn)以脂肪變性和小葉炎癥為特征的脂肪性肝炎,，而在HFLC小鼠中只觀察到脂肪變性。

B）血清ALT和AST水平,。HFHC小鼠ALT水平和AST水平顯著高于HFLC和NC小鼠,。

C） 細(xì)胞因子譜法測(cè)定喂養(yǎng)NC、HFLC和HFHC飼料的小鼠第14個(gè)月的血清IL-6,、IL-1抑制因子和IL-1蛋白水平,。這些指標(biāo)的水平均有所上升。

D）在喂養(yǎng)NC、HFLC和HFHC飼料的小鼠第14個(gè)月時(shí)用ELISA法測(cè)定小鼠肝臟促炎細(xì)胞因子IL-6,、IL-1α和IL-1β蛋白水平,，RNA測(cè)序測(cè)定Cx3cl1、Mcp1,、Cxcl10,、Mip1β、Mip1α,、CCL5,、Cxcl16、TNFαmRNA水平,。與NASH相關(guān)的促炎細(xì)胞因子Cx3cl1等在HFLC小鼠肝組織中顯著上調(diào),。

E） 從上至下依次為天狼星紅染色和免疫組化染色。分別觀察膠原沉積和α-SmA蛋白,。RT-PCR法測(cè)定mRNA表達(dá)水平,。HFHC小鼠的肝組織表現(xiàn)出嚴(yán)重的纖維化損傷，膠原分布面積明顯增加,。肝星狀細(xì)胞活化表現(xiàn)為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的基因和蛋白水平升高,。

F） 肝羥脯氨酸含量。其在HFHC小鼠中含量明顯升高,。

G） 肝臟的氧化應(yīng)激檢測(cè),。喂養(yǎng)HFHC飼料的小鼠的肝臟NAD+/NADH比值和SOD活性顯著降低，提示膳食膽固醇可誘導(dǎo)肝臟的氧化應(yīng)激,。

3.   高膽固醇膳食引起小鼠肝臟依次發(fā)展為脂肪肝,、脂肪性肝炎、纖維化和NAFLD-HCC,。

B）從上至下依次為HFLC喂養(yǎng)14個(gè)月和HFHC喂養(yǎng)3,、8、10,、12和14個(gè)月小鼠肝臟大體,、肝臟腫瘤標(biāo)志物AFP和GP73的H&E染色和免疫組化染色、天狼星紅染色,，脂肪變性和炎癥的組織學(xué)評(píng)分以及天狼星紅染色定量的肝膠原面積,。HFHC小鼠肝臟組織學(xué)在3個(gè)月時(shí)表現(xiàn)為輕度炎癥性脂肪變性，8個(gè)月時(shí)脂肪性肝炎伴纖維化,，10,、12、14個(gè)月時(shí)肝癌形成,，而HFLC小鼠在3,、8,、10、14個(gè)月時(shí)僅表現(xiàn)為脂肪變性而沒有進(jìn)一步發(fā)展成肝癌,。HFHC小鼠的腫瘤標(biāo)志物免疫組化染色觀察到陽性染色,，HFLC小鼠沒有。

C）在HFHC膳食控制下的不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠的最大肝腫瘤的腫瘤發(fā)病率,、腫瘤數(shù)量和最大腫瘤直徑,。

4. NAFLD-HCC的腸道菌群失調(diào)與膽固醇水平相關(guān)。

A）14月齡的HFLC和HFHC小鼠之間的腸道微生物的PCoA分析,、香濃多樣性和豐富度分析,，PCoA分析中P<0.001. HFHC小鼠的微生物多樣性更低，豐富度更高,。

B）14月齡的HFLC和HFHC小鼠的糞便細(xì)菌熱圖。

C）HFHC膳食控制3,、8和14個(gè)月后的腸道微生物的PCoA和冗余分析,。發(fā)現(xiàn)HFHC_3m、HFHC_8m和HFHC_14m的小鼠的腸道微生物群落明顯聚類,，這表明腸道微生物組成隨NAFLD-HCC進(jìn)展階段的變化而變化,。

D）在HFHC飼養(yǎng)3、8 ~ 14個(gè)月,，用Chao1指數(shù)測(cè)定微生物群落豐富度,，發(fā)現(xiàn)其逐漸升高。隨著NAFLD-HCC進(jìn)展,，細(xì)菌豐富度依次增加,。

E）喂養(yǎng)HFLC和HFHC的小鼠腸道菌群的色氨酸代謝能力。HFHC小鼠腸道菌群的色氨酸代謝能力降低,。綜上,，高膽固醇膳食導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和微生物色氨酸代謝受損。

F）細(xì)菌豐度與小鼠表型的相關(guān)性,。

G）在59例高膽固醇血癥患者和39例健康人的研究中,，人血清總膽固醇、甘油三酯,、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇（橫軸）與細(xì)菌（縱軸）基因組測(cè)序的相關(guān)性,。雙歧桿菌和類桿菌與血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān),，與高密度脂蛋白膽固醇呈正相關(guān),。

5. 膳食中的膽固醇通過誘導(dǎo)代謝產(chǎn)物的改變而促進(jìn)NASH-HCC的進(jìn)展。膽固醇通過調(diào)節(jié)宿主血清代謝物,，以及至少部分通過增加TCA和降低IPA,，促進(jìn)了NASH-HCC的進(jìn)展,。

A） 主成分排序分析表明，膳食膽固醇含量對(duì)血清代謝產(chǎn)物有顯著影響

B）HFHC小鼠的具有差異的富集代謝物的通路分析,。膽汁酸合成是關(guān)鍵,。

C） [endif]血清代謝組學(xué)火山圖，指示了HFLC和HFHC小鼠的代謝產(chǎn)物的異常值,。初級(jí)膽汁酸包括?；悄懰?TCA)、TUDCA,、甘膽酸(GCA)和TCDCA,，這些也是HFHC小鼠中異常上調(diào)的代謝物。IPA是微生物色氨酸代謝的產(chǎn)物,，也是HFHC小鼠中異常下調(diào)的代謝物,。

D） [endif]HFLC和HFHC飼料喂養(yǎng)3個(gè)月的小鼠門靜脈LPS濃度和14個(gè)月的小鼠結(jié)腸組織E- cadherin表達(dá)。兩者相比,，HFHC小鼠門靜脈血清脂多糖(LPS)濃度升高,，結(jié)腸E-鈣粘蛋白丟失。提示膳食膽固醇可損害腸道屏障功能

E） [endif]微生物與代謝物的相關(guān)性分析,。紅色呈正相關(guān),，藍(lán)色呈負(fù)相關(guān)。

F） [endif]HFLC和HFHC飼料喂養(yǎng)小鼠肝臟組織中Cyp7a1,、Cyp8b1,、Cyp27a1和Cyp7b1 mRNA水平。高膽固醇膳食不能改變肝臟中細(xì)胞色素P450 (Cyp)7a1,、Cyp8b1,、Cyp27a1、Cyp7b1等膽汁酸合成酶的mRNA表達(dá),。

G）  [endif]油紅O染色顯示,，TCA加重膽固醇誘導(dǎo)的人LO2細(xì)胞甘油三酯的積累，IPA抑制膽固醇誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞,、HKCI-2和HKCI-10細(xì)胞甘油三酯的積累,。

H） [endif]IPA抑制NASH-HCC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖。

6. 膳食膽固醇調(diào)節(jié)的腸道菌群通過誘導(dǎo)代謝產(chǎn)物的改變,，促進(jìn)NAFLD和肝細(xì)胞的增殖,，從而促進(jìn)膽固醇誘導(dǎo)的NAFLD-HCC的形成。

A）將喂養(yǎng)NC,、HFLC和HFHC飼料的小鼠(14個(gè)月)的糞便移植到NC條件下的無菌小鼠(G- NC,、G-

HFLC和G- HFHC)中。圖中為G- NC組,、G- HFLC組和GHFHC組灌胃無菌小鼠肝臟的大體形態(tài)和組織學(xué)檢查,。G- HFHC小鼠在14月齡時(shí)出現(xiàn)一個(gè)肝結(jié)節(jié),，而在8月齡和10月齡時(shí)未出現(xiàn)肝結(jié)節(jié)。組織學(xué)檢查證實(shí)該結(jié)節(jié)發(fā)育不全,，有小球狀增生,，細(xì)胞增殖增強(qiáng)。

B） [endif]8,、10,、14月齡時(shí)，G-NC,、G-HFLC和G-HFHC組無菌受體小鼠的肝臟甘油三酯含量,、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和肝組織學(xué)改變。FMT后8,、10,、14個(gè)月，G-HFHC小鼠肝臟脂質(zhì)積累明顯增加,，并伴有肝組織損害

C） [endif]G-NC、G- HFLC,、G-HFHC組小鼠14月齡時(shí)的肝臟IL-6蛋白水平。

D） [endif]肝切片Ki-67染色,?？梢娫?4月齡時(shí)，G-HFHC小鼠中肝細(xì)胞增殖增加,。但在FMT后8個(gè)月和10個(gè)月時(shí)肝細(xì)胞增殖并未見增加,。

E） [endif]腫瘤通路檢測(cè)。圖中直方圖向上表示基因表達(dá)上調(diào),，向下為下調(diào),。免疫印跡法驗(yàn)證CDC20（細(xì)胞增殖）表達(dá)上調(diào)。

F） [endif]G-NC,、G- HFLC,、G-HFHC小鼠腸道微生物群的PCA分析和LDA直方圖。在不同的膳食控制下,，腸道菌群的差異很大,。

G）  [endif]G- HFLC和G- HFHC小鼠血清代謝組學(xué)分析。G- HFHC小鼠的IPA較G-HFLC小鼠降低,，與喂養(yǎng)HFHC飼料的常規(guī)小鼠一致,。

7. 降膽固醇治療完全抑制了高脂血癥小鼠NAFLD-HCC的形成。

A）阿托伐他汀治療喂養(yǎng)HFHC飼料的C57BL/6小鼠的示意圖,。給小鼠喂食HFHC 飼料7個(gè)月,，并繼續(xù)喂食HFHC飼料和阿托伐他汀7個(gè)月。（HFHCAt）

B）HFHC小鼠的肝組織HE染色及肝臟大體形態(tài),，分別計(jì)算了其脂肪變性和炎癥的組織學(xué)評(píng)分。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(14個(gè)月),，阿托伐他汀完全抑制了HFHC飲食誘導(dǎo)的NAFLD-HCC的形成，并改善了NASH的嚴(yán)重程度,。

C）從左至右分別為血清膽固醇水平、肝臟游離膽固醇水平,、血清甲胎蛋白水平，顯著降低,。

D） 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),、血清促炎細(xì)胞因子(IL-6,、IL-1α,、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1,、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α和巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1β)顯著降低,。

E）阿托伐他汀通過顯著減少肝臟膠原沉積和羥脯氨酸含量來改善肝纖維化

F）用NC、HFLC和HFHC飼料喂養(yǎng)的小鼠,，在阿托伐他汀治療或不治療的情況下,，糞便中細(xì)菌的Chao1指數(shù)和熱圖。經(jīng)阿托伐他汀治療后,，HFHC喂養(yǎng)的小鼠腸道菌群豐富度顯著恢復(fù),。

G）被灌服HFHCAt(阿托伐他汀治療的HFHC喂養(yǎng)小鼠)糞便的無菌小鼠的肝臟大體形態(tài),、組織學(xué)檢查,、甘油三酯和脂質(zhì)過氧化含量。與G-HFHC組相比,，G-HFHCAt組小鼠肝臟組織學(xué)有所改善,，肝臟甘油三酯和脂質(zhì)過氧化水平降低。

H）膽固醇誘導(dǎo)的NAFLD-HCC發(fā)生機(jī)制示意圖,。膽固醇破壞膽汁酸代謝和微生物色氨酸代謝,，導(dǎo)致血清TCA增強(qiáng)，IPA降低,，從而促進(jìn)NAFLD-HCC的發(fā)展,。

結(jié)論

長(zhǎng)時(shí)間的高膽固醇飲食通過調(diào)節(jié)腸道微生物群,，誘導(dǎo)雄性小鼠NAFLD-HCC自發(fā)和進(jìn)行性發(fā)展。膽固醇破壞膽汁酸代謝和微生物色氨酸代謝,，導(dǎo)致血清TCA增強(qiáng),，IPA降低，從而促進(jìn)NAFLD-HCC的發(fā)展,。降膽固醇治療完全抑制了膳食膽固醇誘導(dǎo)的NAFLD-HCC的形成,。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，抑制膽固醇和調(diào)控腸道菌群及其相關(guān)代謝產(chǎn)物可能是預(yù)防NAFLD-HCC的有效策略,。