阿貝公式,，我在1981年的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,，就加以介紹，當(dāng)時(shí)教材只講公式內(nèi)容,，沒(méi)有提“阿貝”的姓名,。

      在以前的博客中，也介紹過(guò)突破分辨極限的種種努力,。這次,，這方面的工作，獲得諾貝爾獎(jiǎng)了,。

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡只能分辨到0.2微米,。使用熒光分子,，科學(xué)家現(xiàn)在能夠?qū)铙w細(xì)胞如紅細(xì)胞、細(xì)菌,、酵母細(xì)胞和游動(dòng)的精子內(nèi)單個(gè)分子之間的相互作用進(jìn)行觀察,，也可以走納米水平上識(shí)蹤疾病相關(guān)蛋白的聚集。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獎(jiǎng)勵(lì)給了在這一領(lǐng)域做出突出貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家,。

17世紀(jì),，科學(xué)家第一次用光學(xué)顯微鏡（是虎克吧）研究活體細(xì)胞，打開(kāi)了人類觀察微觀世界的大門(mén),。此后,，光學(xué)顯微鏡成為生命科學(xué)最有用的工具。電子顯微鏡雖然有更高的分辨率,，但必須經(jīng)過(guò)復(fù)雜的標(biāo)本處理過(guò)程,，也無(wú)法觀察活體細(xì)胞。

長(zhǎng)期以來(lái),，受到光學(xué)性質(zhì)的限制,，光學(xué)顯微鏡無(wú)法獲得非常精確的分辨率。1873年,，顯微鏡學(xué)家Ernst Abbe發(fā)表了一個(gè)著名的方程，計(jì)算出了顯微鏡能觀察到的最大極限,，提出影響分辨率的最重要因素是光線的波長(zhǎng)。這導(dǎo)致科學(xué)家一直到20世紀(jì)都不敢奢望能提高光學(xué)顯微鏡的分辨率,。根據(jù)這一說(shuō)法,，光學(xué)顯微鏡永遠(yuǎn)都無(wú)法觀察區(qū)分距離小于光波波長(zhǎng)1/2以下的兩個(gè)目標(biāo),，就是0.2微米,，這幾乎成為了顯微鏡領(lǐng)域的一個(gè)玻璃天花板,。這意味著，用光學(xué)顯微鏡只能觀察到線粒體的輪廓,，比這更小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)都無(wú)法觀察,，觀察單個(gè)蛋白分子就更別指望了。這就好像你觀察細(xì)胞這個(gè)成市,，只能觀察這個(gè)城市內(nèi)的大型建筑,，但不能看到城市中的活動(dòng)的居民,。但為了更深入研究細(xì)胞的功能，科學(xué)家特別需要了解分子水平的細(xì)節(jié),，于是形成了一個(gè)僵局。

這時(shí),，受激發(fā)射損毫（STED）熒光顯微鏡等顯微鏡技術(shù)橫空出世,，徹底打破了這個(gè)僵局。在這個(gè)歷史時(shí)期,，三位卓越的科學(xué)家做出了思想和技術(shù)上的突出貢獻(xiàn),。他們獲得諾貝爾獎(jiǎng)，可謂實(shí)至名歸,。

更有意思的是,，他們背后的故事也十分十分精彩，請(qǐng)看下面的介紹,。

Stefan Hell

羅馬尼亞物理學(xué)家Stefan Hell最早從理論上推翻了Ernst的觀點(diǎn),。他是首位不僅從理論上論證了，而且用實(shí)驗(yàn)證明了使用光學(xué)顯微鏡能達(dá)到納米級(jí)分辨率的科學(xué)家,。上世紀(jì)80年代,，Stefan Hell發(fā)現(xiàn)，如果不像常規(guī)使用一個(gè)透鏡聚焦,，而是將兩個(gè)大孔徑透鏡組合在一起,，可以提高光學(xué)顯微鏡分辨率,。Stefan Hell是首位發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的研究人員,。1990年Hell博士畢業(yè)后，Hell決定獨(dú)自一人繼續(xù)在家研究以上的發(fā)現(xiàn),，并最終成功發(fā)明了4Pi顯微鏡,。哈佛大學(xué)化學(xué)系教授Sunney了解到Hell發(fā)明的4Pi高分辨率顯微鏡時(shí)，對(duì)Hell勇敢挑戰(zhàn)傳統(tǒng)物理學(xué)觀點(diǎn)的精神表示贊許,。

1991年,，獲得了德國(guó)科學(xué)基金會(huì)的獎(jiǎng)學(xué)金，Hell帶著他的4Pi高分辨率顯微鏡到了歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室作博士后,。當(dāng)時(shí)許多科學(xué)家都認(rèn)為Hell的工作對(duì)于提高光學(xué)顯微鏡的分辨率沒(méi)有太大意義,。他們認(rèn)為Hell僅用他那少得可憐的科研經(jīng)費(fèi)來(lái)從事這項(xiàng)研究簡(jiǎn)直就是在冒險(xiǎn),。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率顯微鏡證明了他的確能將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率提高3~7倍,。然而Hell只提高了Z方向的分辨率,，他并沒(méi)有突破衍射極限。

此后Hell又在芬蘭土爾庫(kù)大學(xué)得到了他的第二個(gè)博士后職位,。一個(gè)星期六早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有關(guān)光學(xué)量子理論的書(shū),，突然靈光一閃,，Hell腦海里浮現(xiàn)了一個(gè)想法：如果使用一種合適的激光,，僅激發(fā)一個(gè)點(diǎn)的熒光基團(tuán)使其發(fā)光,，然后再用一個(gè)面包圈樣的光源抑制那個(gè)點(diǎn)周圍的熒光強(qiáng)度，這樣就只有一個(gè)點(diǎn)發(fā)光并被觀察到了,。Hell給他的這項(xiàng)發(fā)明取名STED,，即受激發(fā)射損耗顯微鏡。有了這個(gè)想法后,，Hell立即行動(dòng)，沖進(jìn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),。每當(dāng)回想起當(dāng)時(shí)的心情,，Hell都會(huì)覺(jué)得那是他科研生涯中最激動(dòng)的時(shí)刻。1994年,，Hell在《光學(xué)快報(bào)》上發(fā)表了關(guān)于STED的理論文章,。直到多年后,，這項(xiàng)理論才得以在實(shí)踐中被證實(shí)。

1997年,，Hell與馬普生物物理化學(xué)研究所簽訂了一份長(zhǎng)達(dá)5年的合同,，以繼續(xù)他的STED研究,。1999年,，Hell將他的研究成果分別投給了《自然》和《科學(xué)》雜志,，都被退稿,。2000年,，PNAS發(fā)表了Hell的成果。Hell的STED技術(shù)讓人們第一次得到了納米級(jí)的熒光圖像,，Hell的工作由此獲得了廣泛的肯定,，2002年，他獲得了馬普研究所的終身職位,。從此,，Hell一直在馬普研究所從事成像技術(shù)的研究工作。

W. E. Moerner

他是觀察到熒光分子的第一人,。在化學(xué)領(lǐng)域,，通過(guò)測(cè)量吸收光譜和熒光光譜,，科學(xué)家可以同時(shí)研究數(shù)以百萬(wàn)的分子。但是化學(xué)上是檢測(cè)的整體光譜，只能計(jì)算平均值,。雖然如此，科學(xué)家一直夢(mèng)想能分析單個(gè)分子,，只有這樣才能獲得更豐富更準(zhǔn)確的關(guān)于分子的信息,，對(duì)生物學(xué)家來(lái)說(shuō)，這樣才能更好地理解生物分子的作用,。1989年,，W. E. Moerner是世界上第一個(gè)實(shí)現(xiàn)了通過(guò)吸收光譜觀察單個(gè)分子技術(shù)的科學(xué)家，這是一個(gè)關(guān)鍵的成就,。當(dāng)時(shí)他正在加州IBM公司研究中心工作,。這一工作給其他許多科學(xué)家從事單分子成像研究提供了思想基礎(chǔ)。8年后,，他利用綠色熒光蛋白技術(shù)將單分子成像研究推進(jìn)了一步,。

1997年，W. E. Moerner到加州大學(xué)圣地亞哥分校工作,，和諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Roger Tsien一起工作,，Roger Tsien正在嘗試將綠色熒光蛋白變成多種顏色。綠色熒光蛋白是從水母熒光物質(zhì)分離出的蛋白,，利用這個(gè)蛋白和基因工程技術(shù)可以將許多蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記,。

W.E. Moerner 發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白能根據(jù)需要進(jìn)行開(kāi)關(guān),，當(dāng)使用488納米波長(zhǎng)的光線激發(fā)時(shí),，蛋白開(kāi)始發(fā)熒光，隨后熒光會(huì)很快逐漸變淡,，此時(shí)繼續(xù)用488納米波長(zhǎng)的光線激發(fā)則無(wú)法繼續(xù)發(fā)熒光,，當(dāng)時(shí)如果換用405納米波長(zhǎng)的光線激發(fā)，可以再次激發(fā)出熒光,。而且此時(shí)發(fā)出熒光仍然是488納米波長(zhǎng),。就好像蛋白能復(fù)活一樣。Moerner將這些蛋白分散到凝膠內(nèi),，使這些蛋白分子之間的距離可以小于Abbe的顯微鏡觀察極限距離0.2微米,。天才的Moerner讓這些分子在不同時(shí)間發(fā)出熒光，就好像是許多燈泡按照要求分別打開(kāi)一樣,，他成功地突破了Abbe顯微鏡觀察極限,。研究論文1997發(fā)表在《自然》上。利用這個(gè)發(fā)現(xiàn),，Moerner提出用熒光顯微鏡可以進(jìn)行單分子研究,。2年后Eric Betzig實(shí)現(xiàn)了這個(gè)想法。

Eric Betzig

和Stefan Hell一樣，Eric Betzig也是一直希望突破衍射極限,。90年代,，他正在新澤西州貝爾實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)一種近場(chǎng)顯微鏡，近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡是采用亞波長(zhǎng)尺度的探針在距離樣品表面幾個(gè)納米的近場(chǎng)范圍進(jìn)行掃描成像的技術(shù),。如利用孔徑在20-90nm的近場(chǎng)探針在樣品上進(jìn)行掃描而同時(shí)得到分辨率高于衍射極限的形貌像和光學(xué)像的顯微鏡,。

近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡能夠突破光學(xué)衍射極限，雖然不是非常強(qiáng)大,。對(duì)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行更精細(xì)觀察,。

1995年，Eric Betzig認(rèn)為近場(chǎng)顯微鏡不能繼續(xù)提高分辨率,，另外他認(rèn)為不適合搞學(xué)術(shù)研究,，就停止了學(xué)術(shù)職業(yè)，他從貝爾實(shí)驗(yàn)室辭職,，但他又不知道該干什么,。但是Abbe光學(xué)衍射極限問(wèn)題一直在他頭腦中陰魂不散，當(dāng)他在一個(gè)寒冷的夜晚散步時(shí),，一個(gè)新的想法來(lái)襲,，是否可以用分子的不同性質(zhì)來(lái)突破這個(gè)極限？例如可以發(fā)出不同熒光的分子,。

受到W. E. Moerner的啟發(fā),，Eric Betzig很快使用近場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)了單分子熒光檢測(cè)，然后他開(kāi)始思考,，是否可以用普通顯微鏡檢測(cè)能發(fā)出不同熒光的單分子,。這個(gè)思路就是用顯微鏡對(duì)每種顏色進(jìn)行分別照相，只要同一種顏色的分子距離沒(méi)有小于Abbe光學(xué)衍射極限的0.2微米,，最后將不同顏色的照片進(jìn)行重疊獲得不同顏色的照片,，這樣不同顏色的分子即使距離非常接近達(dá)到納米水平，因?yàn)槭遣煌瑫r(shí)間采集的信號(hào),，所以可以進(jìn)行精確區(qū)分,。這正是突破光學(xué)衍射極限的理想辦法。不過(guò)在當(dāng)時(shí)在實(shí)施中存在一些問(wèn)題,，例如缺乏足夠光學(xué)性質(zhì)的分子,。

1995年，Eric Betzig在《光學(xué)通訊雜志》發(fā)表了他的理論思路,，此后離開(kāi)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)到他父親的公司工作,。此后多年，Eric Betzig與學(xué)術(shù)界脫離了聯(lián)系,。突然有一天,，對(duì)科學(xué)的渴望再次讓他返回了科學(xué)界,。真正的突破發(fā)生在2005年，當(dāng)他了解到能隨意控制熒光蛋白,，Eric Betzig意識(shí)到熒光蛋白的這種特征能幫助實(shí)現(xiàn)他10年前的想法,。這些熒光分子不必要發(fā)射不同顏色,，它們只需要在不同時(shí)間發(fā)射熒光就能解決問(wèn)題,。只用了一年時(shí)間，Eric Betzig就實(shí)現(xiàn)了這個(gè)技術(shù),。

他們將熒光蛋白和溶酶體蛋白融合,。使用光脈沖將蛋白激發(fā)出熒光，因?yàn)槭褂玫墓饷}沖比較微弱,，只有一定比例的蛋白被激發(fā),。因?yàn)榘l(fā)熒光的分子比例足夠小，幾乎所有能發(fā)熒光的分子距離都足夠遠(yuǎn),，超過(guò)光學(xué)衍射極限0.2微米的距離,。這樣這些分子就都可以在光學(xué)顯微鏡下精確地分辨出來(lái)。等一會(huì)時(shí)間,，當(dāng)這些熒光淬滅后,，再進(jìn)行一輪激發(fā)和采集信號(hào)過(guò)程，這樣又可以獲得另外一組分子的圖片,。將這個(gè)步驟多次重復(fù)后,，就可以獲得許多張區(qū)分度良好的隨機(jī)采集的目標(biāo)分子照片。最后將這些照片疊加起來(lái),，就獲得了超級(jí)高分辨率溶酶體的顯微鏡照片,。

The centre image shows lysosome membranes and is one of the first ones taken by Betzig using single-molecule microscopy. To the left, the same image taken using conventional microscopy. To the right, the image of the membranes has been enlarged. Note the scale division of 0.2 micrometres, equivalent to Abbe’s diffraction limit. The resolution is many times improved. Image from Science 313:1642–1645.

這確實(shí)是天才想法！他們拿到超過(guò)Abbe極限的溶酶體結(jié)果后,，《科學(xué)》2006年接受并發(fā)表了他們的天才論文,。

德國(guó)馬普學(xué)會(huì)一家研究所的閻王爺先生 Stefan W. Hell 發(fā)明的STED 技術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy），我覺(jué)得是板上釘釘要得,，不知道是那一年,。同時(shí)和這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的還有　STORM和 PALM 技術(shù)。個(gè)人覺(jué)得后面兩種以及變種不太靠譜,，技術(shù)復(fù)雜后處理麻煩也不實(shí)用,，純粹玩玩而已。但是現(xiàn)在授獎(jiǎng)很可能有糾結(jié)產(chǎn)生糾紛,，因?yàn)榻o了第一個(gè)后面兩個(gè)會(huì)有意見(jiàn),。反正大家都年輕，最好等幾年,，適者生存,，如果后面的技術(shù)被時(shí)間淘汰掉了,，諾獎(jiǎng)委員會(huì)就好辦了。

    光學(xué)顯微鏡有個(gè)分辨率的極限問(wèn)題，大概是半個(gè)光學(xué)波長(zhǎng),，比這個(gè)波長(zhǎng)更小的物體,，就分辨不出來(lái)了，比如使用400納米的光,，分辨率就是200納米左右,。這個(gè)極限大概19世紀(jì)就知道了，最近二十年才被打破,，所以意義重大,，所用的手段是純粹的物理學(xué)，所以說(shuō)今年的化學(xué)諾獎(jiǎng)是物理學(xué)的勝利,。

    以前有雙光子顯微鏡,，可以稍微低于這個(gè)分辨率極限，但是實(shí)際上就在極限上工作,。所謂的超分辨率熒光顯微鏡,，就是打破了這個(gè)分辨率的極限，比如還用400納米的光,，可以容易分辨200納米以下的物體,，甚至可以達(dá)到20納米。

    以前的顯微鏡總是用一束光,，這束光是一根細(xì)絲,，聚焦到一個(gè)很小的小點(diǎn)上,，這個(gè)小點(diǎn)就是分辨率極限。由于光的衍射效應(yīng),，這個(gè)小點(diǎn)的大小受到光的波長(zhǎng)的限制,。這也是自從人類發(fā)明光學(xué)顯微鏡以來(lái)，困擾了200多年的難題,。

    閻王爺先生的超分辨熒光顯微鏡叫做STED, 基本原理是用兩束光,，實(shí)際上是兩束激光，一束是正常的光聚焦到一個(gè)小點(diǎn)上,，下圖左邊,，這個(gè)就是衍射極限的最大分辨率,；另一束激光變成中空的筒子一樣,，下圖中間；兩束光聚焦到同一點(diǎn)上,，由于第二束光把第一束光給滅了,，只有中間那點(diǎn)沒(méi)有滅掉，所以才能看到,，這個(gè)更小的小點(diǎn)就是新的分辨率,，打破了衍射極限，下圖右邊,。這就是這個(gè)項(xiàng)目的重大意義所在,。

    這樣，使用這樣的光學(xué)顯微鏡就可以清楚看到更小的物體,，比如納米材料的形貌,，更廣泛的應(yīng)用是在生物學(xué)領(lǐng)域，比如下圖,，等待生物學(xué)專業(yè)人士來(lái)科普,。

    順便說(shuō)一句，中國(guó)目前是否有這樣的超分辨光學(xué)顯微鏡我還不清楚,，北大的席鋒那里可能有,，質(zhì)量和運(yùn)性情況不知道，其他單位沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò),。

    比這個(gè)顯微鏡更低檔一點(diǎn)是,，雙光子顯微鏡，所用的激光就是飛秒激光,，國(guó)內(nèi)估計(jì)總共有50臺(tái)左右,，價(jià)格每臺(tái)300萬(wàn)到600萬(wàn)元，全部西方制造,，只有五家公司：尼康,，奧林巴斯,，萊卡和蔡斯等。

    更低一點(diǎn)檔次的顯微鏡是激光顯微鏡,，每臺(tái)大概200萬(wàn)元,，國(guó)內(nèi)估計(jì)200臺(tái)到300臺(tái)之間，只有西方制造,。

    還有電子顯微鏡,，分辨率可以達(dá)到0.1納米或許更小，遠(yuǎn)遠(yuǎn)比這個(gè)超分辨的光學(xué)顯微鏡高,，但是各有優(yōu)缺點(diǎn),。以后抽空再來(lái)評(píng)述。http://blog.sina.com.cn/ho040625 

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