1、細(xì)胞太少或細(xì)胞密度太大

細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響,。不同的轉(zhuǎn)染試劑,，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑,，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低,。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等,。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù),，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間,，盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染,，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。

2,、電壓過(guò)大

做電轉(zhuǎn)的時(shí)候,，如果電壓太大，往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況,。不同的細(xì)胞,，需要的電壓是不一樣的。

3,、未加血清

血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷,，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低,。不過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō),，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽(yáng)離子聚合物等,。

轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清,，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。也可以在原來(lái)的無(wú)血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。

4、細(xì)胞污染

細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因,。首先,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無(wú)菌。而現(xiàn)在市場(chǎng)上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對(duì)無(wú)菌,。

如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞,，那就可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生,。

5,、 轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA,，RNA,，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果,。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高,，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期,，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,，此外還需考慮一些安全問(wèn)題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外,，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用,，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要,，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾,。

轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2μg以上,。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。這個(gè)時(shí)候,，就應(yīng)該對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮,。

6、試劑過(guò)期

有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下,，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過(guò)期的情況,。

7、不注意細(xì)節(jié)

在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基,，可提高轉(zhuǎn)染效率,。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來(lái)，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié),，但是,，如果不注意的話，也會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下,。

8,、細(xì)胞狀態(tài)不好

有時(shí)會(huì)存在不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，轉(zhuǎn)染時(shí)融合度應(yīng)為70%-90%,。細(xì)胞狀態(tài)不好,，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,。如果是貼壁細(xì)胞的話,，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話,，應(yīng)該是6X105個(gè)/孔（24孔板）,，一般是轉(zhuǎn)染前一天換液，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。轉(zhuǎn)染的整個(gè)過(guò)程都不應(yīng)該有抗生素,。

9、在轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用抗菌素

在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不要使用氯霉素,，青霉素或鏈霉素,，因?yàn)殛?yáng)離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，篩選抗生素加入的太快,，在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留24-48h使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。