本文是上一篇：「細(xì)胞轉(zhuǎn)染的步驟你了解多少,？」的續(xù)篇

切入正題，但凡做任何事情,，知己知彼,，方能百戰(zhàn)不殆,。做細(xì)胞轉(zhuǎn)染也一樣道理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的影響因素很多,，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(對于困難的細(xì)胞系尤其如此),，需要被轉(zhuǎn)染的分子(DNA、RNA,、寡核苷酸,、蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)染試劑 等,。但無論在何種情況下,，以下八個(gè)要素都不容忽視。

要素一：細(xì)胞

分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA,。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài);此外,，還常用促有絲分裂刺激物(如,，病毒轉(zhuǎn)化，生長因子,，條件培養(yǎng)基,，以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來活化原代培養(yǎng) 細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著,。相對于貼壁細(xì)胞(如HEK,，CHO)，懸浮細(xì)胞(如HL 60,，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染,，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子 水平上合理機(jī)制的解釋,。

分板方案——在對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分板傳代培養(yǎng)之前,，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害,。因此分批方案的不同(如,，胰蛋白酶消化時(shí)間的長短，胰蛋白酶的滅活等)需要優(yōu)化,。

傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)),。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而改變,，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定,。因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力)性質(zhì)也可能會有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染,。

細(xì)胞數(shù)量(融合率)——只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間,，細(xì)胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言,，細(xì)胞生長的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(接觸抑制),，但癌細(xì)胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細(xì)胞生長,。細(xì)胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染,。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及細(xì)胞溶解之前的生長情況相關(guān)。

培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被細(xì)菌,、酵母,、真菌、病毒,、支原體,、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果,。

支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%,，它可改變細(xì)胞生長特性，酶的作用途徑,，細(xì)胞膜的組成,，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率,。特別是,，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐,、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾,，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失,。和細(xì)菌及真菌不同,，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜;它們還對常用抗生素有抗藥性,。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。

要素二：載體DNA

一般原則：對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定,。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系,。在測定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照,。

載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性,。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解,，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響,。

載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl,，內(nèi)毒素)可能會影響轉(zhuǎn)染效率,。

載體構(gòu)造(啟動子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV,，CMV,，和SV40)的對照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而,，病毒啟動子/增強(qiáng)子體系的相對有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級,。例如，在某些細(xì)胞系中,，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增,，SV40體系可高效表達(dá)large T抗原(如，COS);而在其他許多細(xì)胞系中,，則是CMV啟動子更為有效,。

除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會有超過一個(gè)數(shù)量級的差異,，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的,。

要素三：組織培養(yǎng)試劑

一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,，并盡可能減少所用試劑的變更,。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖),，維生素,，無機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì),。有些成分非常不穩(wěn)定,，因此如果在使用時(shí)不是新鮮，加入就可能會產(chǎn)生問題,。配置時(shí)要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì),，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì),。

胎牛血清——血清是一種含有白蛋白,、球蛋白、生長促進(jìn)因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物,。采集血清所用動物的年齡,、營養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。

添加劑——某些細(xì)胞的生長依賴于一些對生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)(如,，生長因子,，微量元素，必需代謝物和蛋白等),。

CO2培養(yǎng)箱——細(xì)胞生長所需環(huán)境為37℃,、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值,，細(xì)胞生理對pH的變化非常敏感,，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值,，而另一些則需要10%的CO2,。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度,、濕度和CO2)則會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異,。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì),，或真菌/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理,。

要素四：使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白

以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，然后挑選一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集,。而挑選這樣一個(gè)細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率,。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性,，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低,。

而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少,，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長速度大大超過轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白,。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑,，就可獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)。

現(xiàn)將一些影響蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素分列如下：

細(xì)胞系 (有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高)

質(zhì)粒骨架 (例如：增強(qiáng)子,，啟動子,，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)

目的蛋白 (有些蛋白很難獲得高表達(dá)量)

目的蛋白的cDNA序列 (例如：密碼子的優(yōu)化)

培養(yǎng)條件 營養(yǎng)物，代謝廢物,，轉(zhuǎn)染抑制物)

當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化,，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物(轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)粒)后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克隆,。

要素五：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的第一步是選擇一種同時(shí)含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體,。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。

一旦選好了質(zhì)粒載體,，無論瞬時(shí)或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法,。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用,。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死,。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長,。有的時(shí)候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中,，以維持對細(xì)胞的選擇壓力,。

要素六：轉(zhuǎn)染方案

一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過改變試劑/DNA的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化,。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比,，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值,，以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能,。質(zhì)粒可用無菌水或TE緩沖液稀釋,。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑,，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清,，它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制,。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大,。

轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比)——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個(gè)試劑/DNA配比時(shí)最為有效,。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。

形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑——對于多數(shù)試劑而言,，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成,。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入——有兩種替換方法可用來將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1.將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋,，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作,。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性,，所以會使結(jié)果的一致性更好,。

要素七：時(shí)間進(jìn)度

一般原則提示：要確保最終結(jié)果的成功;建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到最佳表達(dá)。

轉(zhuǎn)染的開始——在轉(zhuǎn)染前12小時(shí),，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中,。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時(shí)開始轉(zhuǎn)染,，這樣就可以使它們在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100%的融合。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成,。在這段時(shí)間后,，就不會再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。

培養(yǎng)基更換——某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基,。如果轉(zhuǎn)染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行,，那么這一步驟就必不可少。而對于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑時(shí),，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段,，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在培養(yǎng)基中直到進(jìn)行檢測,，那么對有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會有所提高,，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除,，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的,。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要,，這樣一來就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量,。

時(shí)間測定——轉(zhuǎn)染開始后的24-48小時(shí)內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度,、表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng),，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等,。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見了,。

最后就是平時(shí)可能會忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect，轉(zhuǎn)染試劑本身對基因表達(dá)水平(高表達(dá)或低表達(dá))的影響,，有時(shí)候可能會造成假陽性的結(jié)果,。

我自己的體會是，一般的細(xì)胞,，用脂質(zhì)體2000和fugeneHD轉(zhuǎn)染效率相差不大,，雖然最近有文獻(xiàn)說脂質(zhì)體2000脫靶效應(yīng)很高，但國內(nèi)在乎的人貌似不多;但是干細(xì)胞,，原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等一些比較難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系,，F(xiàn)ugene HD比較溫和，細(xì)胞毒性很低,，轉(zhuǎn)染效率明顯要好;懸浮細(xì)胞,，各有千秋，不敢說一定可以,，重在嘗試,，要是都不行,，就電轉(zhuǎn)吧。

要素八：交叉污染

如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞,，那就有可能發(fā)生交叉污染,，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染,。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種,，幾個(gè)月過后它們就會完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物,。