定義：細胞轉染是指將外源分子如DNA,，RNA等導入真核細胞的技術,。

應用：在研究基因功能、調控基因表達,、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,。

簡介：轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術,。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。

一,、轉染的途徑大致可分為物理介導,、化學介導和生物介導三類：

1.物理介導：電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例,。

2.化學介導：方法很多,，如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法,、和多種陽離子物質介導的技術,。

3.生物介導：方法有較為原始的原生質體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術,。

理想細胞轉染方法,，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點,。病毒介導的轉染技術,，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢,。但是,，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性,，在一般實驗室中很難普及,。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

需要指出的一點,，無論采用哪種轉染技術,，要獲得最優(yōu)的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化,。影響轉染效率的因素很多,，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài),，到轉染方法的操作細節(jié),，都需要考慮。

二,、常規(guī)轉染技術：

1.瞬時轉染（transient transfection）：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產生高水平表達,，但通常只持續(xù)幾天,，多用于啟動子和其他調控元件的分析。一般來說,，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24~72h小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果,，常常用到一些報告系統(tǒng)和熒光蛋白,，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

2.穩(wěn)定轉染（Stable transfected）：外源DNA既可以整合到宿主細胞中,，也可能作為一種游離體（episome）存在,。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,，大約1/104轉染細胞能整合,，通常需要通過一些選擇性標記。如來氨丙基轉移酶（APH,；新霉素抗性基因）,，潮霉素磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選,，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系,。

瞬時轉染和穩(wěn)定轉染的比較

三、轉染方式

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成,，這對大分子物質來說是個不可透過的屏障,，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也帶負電荷,。為了使核酸穿過細胞膜,，研究人員開發(fā)了多種技術，大致分為三類：化學方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷,。生物方法---利用基因工程病毒轉染非病毒基因到細胞中,。物理方法---在細胞膜表面產生一個瞬時的孔從而導入DNA。然而,，沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗,，理想的方法應根據(jù)您的細胞類型和實驗需要進行選擇，理想的方法應具有高轉染效率,，低細胞毒性和對正常生理學的影響最小,，并且易于使用和可重復性等特點。

四、部分轉染方法的原理及步驟：

1,、陽離子脂質體介導的轉染

原理：陽離子脂質體介導的轉染是目前最常用的轉染方式之一,。陽離子脂質的基本結構由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成，帶正電荷的頭基與帶負電荷的核酸通過靜電作用形成復合物,，經細胞的內吞作用進入細胞,。

實驗步驟：將DNA，RNA,，siRNA或寡核苷酸和轉染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中,，脂質體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經細胞內吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況,。

2、磷酸鈣共沉淀

原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物,，然后將其分散在培養(yǎng)的細胞上,，磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細胞表面的結合，DNA通過內吞作用進入細胞,。

實驗步驟：將氯化鈣和DNA混合,，以可控的方式加入磷酸緩沖液?！谑覝叵路跤?，以形成極細，可溶的共沉淀微?！鷮⒘姿徕}-DNA沉淀物加入細胞中,，后者能黏附到細胞膜表面→共沉淀物經細胞內吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

3,、病毒轉染

原理：對于用脂質體不能實現(xiàn)轉染的細胞,，可以采用病毒轉染。腺病毒,，逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞體內外的基因轉染,。

實驗步驟：通過基因克隆方法獲得重組病毒表達載體→轉染包裝細胞系，擴增并分離得到重組病毒顆?！兓⒌味ú《疽骸D導目的細胞（含有病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達或沉默情況,。

4、電轉

原理：利用電脈沖在細胞膜上形成暫時的孔使核酸物質能穿過孔進入細胞,。

實驗步驟：利用電轉緩沖液重懸細胞→對含有核酸,，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差,，誘導產生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中,，使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。

五,、影響轉染試驗的因素

1．轉染試劑

      不同細胞系轉染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要,，因此在轉染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑,。每種轉染試劑都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇最適合實驗設計的轉染試劑,。當然,，最適合的是高效、低毒,、方便,、廉價的轉染試劑,。

2．細胞狀態(tài)
      一般低的細胞代數(shù)（<>

3．轉染方法
      不同轉染試劑有不同的轉染方法，但大多大同小異,。轉染時應跟據(jù)具體轉染試劑推薦的方法,，但也要注意，因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質不同,，質粒定量差異,，操作手法上的差異等，其轉染效果可能不同,，應根據(jù)實驗室的具體條件來確定最佳轉染條件,。
（1）細胞培養(yǎng)物
      健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉染的基礎。不同細胞有不同的培養(yǎng)基,，血清和添加物,。高的轉染效率需要一定的細胞密度，一般的轉染試劑都會有專門的說明,。推薦在轉染前24小時分細胞,，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能,。一定要避免細菌,，支原體或真菌的污染。

（2）細胞密度
      細胞密度對轉染效率有一定的影響,。不同的轉染試劑,，要求轉染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑,，也會因不同的細胞類型或應用而異,。轉染時過高或者過低的細胞密度會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低,。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑,，最好能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等,。陽離子脂質體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數(shù),，有的要求細胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質體的配方則要求在40%-80%之間,，總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉染,，以求最佳的轉染效果。不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度,，比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因,，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑,。一般轉染時貼壁細胞密度為50%-90%,，但這個需要參考所選轉染試劑的說明書,。
（3）血清
      血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后洗細胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉染,，但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷,，甚至死亡導致轉染效率極低。不過轉染產品配方幾經革新后的今天,，對于主流的轉染試劑來說,，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率,，如陽離子聚合物等,，血清的存在會影響DNA—轉染復合物的形成，但只要在DNA-轉染復合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉染試劑就可以了,，在轉染過程中是可以使用血清的,。不過要特別注意：對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的,。胎牛血清（FCS）經常用到,，便宜一點的有馬或牛血清。通常的,，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物,，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質量的變化直接影響細胞生長,，因此也會影響轉染效率,。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉染很有幫助。
（4）抗生素
      細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染,，但是這些添加劑可能對轉染造成麻煩,。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養(yǎng)基添加物,。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,，但有些轉染試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞,。這可能間接導致細胞死亡,，造成轉染效率低。目前轉染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作,，非常方便,，省去了污染等麻煩。
（5）氮磷（N/P）比
      N/P比是轉染效率的關鍵（為了換算方便,，一般以DNA/轉染試劑質量比表示）,，在一定比例范圍內轉染效率隨N/P比成比例增高,，之后達到平值,，但毒性也隨之而增加,，因此在實驗之前應根據(jù)推薦比例，確定本實驗的最佳轉染比例,。
（6）DNA質量
      DNA質量對轉染效率影響非常大,。一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純,，如帶少量的鹽離子,，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行,，但對GenEscort系列轉染試劑影響不大,。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質粒抽提試劑盒，能達到兩倍2×CsCl梯度離心以上的純度效果,，使您不必為DNA質量操心,。此外，對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞,，懸浮細胞和造血細胞）,，QIAGEN還提供可去除內毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子,，保證理想的轉染效果,。但如果使用GenEscort轉染試劑，一般不需要這么高的DNA質量要求,。當使用GenEscort轉染試劑時,，即使采用傳統(tǒng)的酚－氯仿沉淀方法純化質粒，仍然可達到非常好的轉染效果,，但所用的質粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些,。

4．載體構建
      轉染載體的構建（病毒載體，質粒DNA,，RNA,，PCR產物，寡核苷酸等）也影響轉染結果,。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高,，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期,，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞,，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構建外,，載體的形態(tài)及大小對轉染效率也有不同的影響,，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉染的影響。如果基因產物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行,，因此選擇組成或可調控,，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾,。