一文掌握Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法

心隨所愿zh 2019-01-21

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一,、技術(shù)原理

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,，受內(nèi)在遺傳機(jī)制控制，按照自身程序主動(dòng)性,、生理性的死亡過(guò)程,。細(xì)胞凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控,，故又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）,。

一般來(lái)說(shuō),，凋亡早期,，主要涉及胞內(nèi)一些蛋白的變化，例如蛋白量的增高,、位置的遷移,、狀態(tài)的改變等，還有一些磷脂,、Ca²⁺的變化等,；中晚期則伴隨著DNA的斷裂、凋亡小體的形成,；而細(xì)胞形態(tài)的改變則伴隨著整個(gè)凋亡過(guò)程,。

二,、產(chǎn)品應(yīng)用

目前可以采用單染色法和雙染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,，流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡觀察來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中Annexin V/PI法是當(dāng)下較為流行的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法,。正常細(xì)胞中,，磷脂酰絲氨（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),，但在早期凋亡細(xì)胞中,，PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中,。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力結(jié)合。用熒光素（FITC,、Alexa Fluor488等）標(biāo)記的Annexin-V作為探針,，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞,，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅,。因此將Annexin-V與PI結(jié)合使用，就可以檢測(cè)出細(xì)胞群體中的早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞,。

Apoptosis-AnnexinV 檢測(cè)示意圖

碘化丙啶PI檢測(cè)示意圖

三,、使用方法

懸浮細(xì)胞，2000rpm離心5min收集細(xì)胞;對(duì)于貼壁細(xì)胞,，要用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,，胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短(過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞膜破碎，造成假陽(yáng)性,，過(guò)短,，細(xì)胞黏連影響檢測(cè))最好是在輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶消化液,，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化,，，2000rpm離心5min收集細(xì)胞,；

4℃預(yù)冷PBS,，洗滌細(xì)胞2次（2000rpm x 5min）,收集細(xì)胞2～5×105 ；

離心棄上清,，加入500μL結(jié)合緩沖液,，輕輕吹打重懸細(xì)胞,；

加入5μL Annexin V-FITC，輕輕吹打混勻,，加入5μL PI 輕輕吹打混勻,室溫避光孵育5-15min,。(PI染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高,時(shí)間允許，可以在檢測(cè)前5分鐘加入PI),；

流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡觀察,。最好在1h內(nèi)檢測(cè)。

四,、注意事項(xiàng)

Annexin V-FITC與PI量微，請(qǐng)?jiān)谑褂们暗退匐x心將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落,；

Annexin V-FITC與PI需低溫避光儲(chǔ)存；

PI有毒,，能透過(guò)皮膚進(jìn)入體內(nèi),，使用時(shí)注意防護(hù)；

本試劑盒適用于細(xì)胞樣本（不能固定）,，不適用于組織檢測(cè),；

所有細(xì)胞在檢測(cè)前細(xì)胞密度達(dá)80%-90%左右即可，細(xì)胞過(guò)密過(guò)多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞本身的大量凋亡,，從而增加了凋亡細(xì)胞的比例,；

對(duì)于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,；細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞,；

包括漂浮在培養(yǎng)基上的細(xì)胞，一起收集,；洗細(xì)胞后,，建議輕輕搖勻細(xì)胞沉淀，避免使用加液槍?zhuān)悦庥捎谒芰蠘岊^的使用造成細(xì)胞損失,；

一次檢測(cè)很多樣本,，加入PI應(yīng)該有一定的時(shí)間間隔（一般以30~60s為宜），因?yàn)镻I本身有毒,；

如果樣品來(lái)源于血液,，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S,，能與Annexin V結(jié)合,，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

盡量去除EDTA,，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合,。

五,、常見(jiàn)問(wèn)題

成功的檢測(cè)凋亡受以下幾種因素的影響，如細(xì)胞類(lèi)型,、細(xì)胞膜上PS的密度,、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法,、所用試劑,、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間等，把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要,；

熒光顯微鏡觀察：滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上,，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察,。Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色,，PI熒光信號(hào)呈紅色；

使用流式細(xì)胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞前要求儀器的熒光補(bǔ)償來(lái)去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加,。因?yàn)闊晒庋a(bǔ)償設(shè)置與PMT的電壓直接相關(guān),，所以不同儀器之間的補(bǔ)償不同。建議在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段分析經(jīng)Annexin V,、PI分別單染的細(xì)胞來(lái)調(diào)整熒光補(bǔ)償去除光譜重疊,。根據(jù)未處理細(xì)胞空白對(duì)照和經(jīng)Annexin V、PI分別細(xì)胞染色后的單染對(duì)照的分析設(shè)定十字門(mén)的位置,；

正常細(xì)胞：Annexin ⅴ-FITC (-),；PI (-),；

早期凋亡細(xì)胞：Annexin ⅴ-FITC (+),；PI (-)；

晚期凋亡細(xì)胞： Annexin ⅴ-FITC (+),；PI (+),；

機(jī)械性壞死：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+),；

對(duì)照組凋亡比例高的原因：

細(xì)胞狀態(tài)不好,；
細(xì)胞收集后存放的時(shí)間太長(zhǎng)，沒(méi)有及時(shí)染色,；
細(xì)胞表面原有的PS相對(duì)較多,，應(yīng)選用低濃度的AnnexinV標(biāo)記；
PBMC表面往往有血小板黏附在細(xì)胞表面,，造成Annexin V陽(yáng)性率偏高,；
過(guò)分吹打、震蕩或胰酶消化等,，可能使PS暴露出來(lái),。

處理組凋亡比例低的原因：

凋亡刺激得不夠,；
細(xì)胞本身生長(zhǎng)狀態(tài)可能對(duì)刺激因素不敏感，如過(guò)度增殖的細(xì)胞對(duì)凋亡的誘導(dǎo)不太敏感,；
Annexin V的結(jié)合緩沖液失效,，應(yīng)4 ℃保存；
貼壁細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，膜表面的PS受損,，Annexin V結(jié)合位點(diǎn)減少。

六,、實(shí)驗(yàn)圖例

1.凋亡誘導(dǎo)劑喜樹(shù)堿（Camptothecin,，CPT）10uM誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞，37℃,，5%CO?培養(yǎng)4h,參照說(shuō)明書(shū)操作,，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如下：

處理前：正常細(xì)胞占比較高，早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞較少,。

（紅色部分為正常細(xì)胞,，藍(lán)色為早期凋亡細(xì)胞，綠色為晚期凋亡細(xì)胞,，品紅為機(jī)械性壞死細(xì)胞）

處理后：正常細(xì)胞明顯減少,，早期凋亡細(xì)胞明顯增加。

（紅色部分為正常細(xì)胞,，藍(lán)色為早期凋亡細(xì)胞,，綠色為晚期凋亡細(xì)胞，品紅為機(jī)械性壞死細(xì)胞）

2.凋亡誘導(dǎo)劑喜樹(shù)堿（Camptothecin,，CPT）10uM誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞,，37℃，5%CO?培養(yǎng)4h,參照說(shuō)明書(shū)操作,，經(jīng)熒光顯微鏡觀察結(jié)果如下：

正常細(xì)胞：無(wú)染色

早期凋亡細(xì)胞：只有膜綠色熒光染色

晚期凋亡細(xì)胞：既有膜綠色熒光染色,，也有核紅色熒光染色

機(jī)械性壞死細(xì)胞：只有核紅色熒光染色。

七,、相關(guān)產(chǎn)品

Annexin V-FITC /PI凋亡試劑盒（點(diǎn)擊查看詳情）

產(chǎn)品貨號(hào)：MK1028

產(chǎn)品價(jià)格：618元/100μl 1098元/250μl 1680元/500μl

試劑盒主要試劑為Annexin V-FITC 及PI,，應(yīng)用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)

試劑組分	MK1028-20(20次實(shí)驗(yàn))	MK1028-50(50次實(shí)驗(yàn))	MK1028-100(100次實(shí)驗(yàn))
Annexin V-FITC	100μL	250μL	500μL
Propidium Iodide(PI)	100μL	250μL	500μL
Binding Buffer	10mL	25mL	50mL

保存條件：Annexin V-FITC與PI需4℃避光儲(chǔ)存， Binding Buffer在4℃儲(chǔ)存,，一年有效,。

—END—

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來(lái)自：心隨所愿zh > 《腫瘤增殖遷移實(shí)驗(yàn)》

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