初次接觸流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)還是在研一的時(shí)候,，那時(shí)候不由分說(shuō)按照說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟,，第一步，第二步....結(jié)果一年過(guò)去了,，應(yīng)該著色的不著色,，應(yīng)該凋亡的不凋亡，終于經(jīng)過(guò)一年的不斷思考和實(shí)驗(yàn)操作的改進(jìn),，研二有了果斷的進(jìn)步?，F(xiàn)在終于有機(jī)會(huì)和大家一起分享，為什么研一的流式研二才出結(jié)果,？

為了方便大家理解我先呈現(xiàn)了一個(gè)結(jié)果圖如下,，就是因?yàn)檫@個(gè)結(jié)果圖困惑了一年，因?yàn)槲业膶?shí)驗(yàn)結(jié)果,，總是會(huì)出現(xiàn)這樣那樣的非正常的現(xiàn)象：

現(xiàn)象（一）當(dāng)做單陽(yáng)管Annexinv-FITC時(shí),，第四象限總是為空，沒(méi)有早期凋亡的細(xì)胞,，98%都是正常細(xì)胞,；

現(xiàn)象（二）當(dāng)做單陽(yáng)管PI時(shí)，第二,，三象限也總是為空,，98%都是正常細(xì)胞；

現(xiàn)象（三）好不容易單染實(shí)驗(yàn)可以著色,，但是在加藥觀察細(xì)胞凋亡的情況時(shí),，總是不盡人意，第三象限總是比第四象限細(xì)胞百分比多,；

現(xiàn)象（四）在實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)中,，第二象限代表機(jī)械性損傷的細(xì)胞總比第四現(xiàn)象早期凋亡的百分比多；

現(xiàn)象（五）細(xì)胞染色不分團(tuán),，做不到理想的流式結(jié)果圖,。

這四個(gè)象限做了一年都沒(méi)有理想的結(jié)果,，但是也經(jīng)過(guò)這一年的時(shí)間潛心的總結(jié)和弄透了原理及方法，終于做出了客觀的結(jié)果,。下面我就給大家總結(jié)一下我的學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn),。希望對(duì)正在做流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)的你能夠答疑解惑。

從細(xì)胞結(jié)構(gòu)開(kāi)始說(shuō)起

真核細(xì)胞的三大重要結(jié)構(gòu)為細(xì)胞膜,，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),。細(xì)胞的周?chē)幸粚佑芍肿与p層和蛋白質(zhì)構(gòu)成的單位膜，稱(chēng)之為細(xì)胞膜或質(zhì)膜,。質(zhì)膜具有通透性,，脂溶性的物質(zhì)很容易通過(guò)質(zhì)膜，水溶性物質(zhì)包括小分子,，是很難透過(guò)質(zhì)膜,，如果想要穿過(guò)質(zhì)膜，需通過(guò)通道實(shí)現(xiàn),。

細(xì)胞膜上的膜脂約占膜的50%,，主要分為3類(lèi)，磷脂,，鞘脂,，和固醇類(lèi)。而磷脂約占膜脂的50%,，磷脂的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),。其頭部基團(tuán)由帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)結(jié)合氮堿基構(gòu)成，例如膽堿,，乙醇胺,，絲氨酸和肌醇等。尾部由兩條長(zhǎng)短不一的烴鏈構(gòu)成,，為非極性的輸水區(qū)如下圖（1）,。膜脂的分布具有不對(duì)稱(chēng)性如下圖（2）。

圖（1）

圖（2）

細(xì)胞凋亡的概念

是細(xì)胞的一種程序性死亡,，首先細(xì)胞會(huì)輕微的蜷縮，染色質(zhì)會(huì)聚集和斷裂,，并且細(xì)胞質(zhì)也凝縮,；繼而細(xì)胞核破裂，細(xì)胞通過(guò)出芽的形式形成一個(gè)個(gè)凋亡小體,，凋亡小體有細(xì)胞膜封閉,，而且會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬，所以不會(huì)有內(nèi)容物釋放,，故不會(huì)發(fā)生炎癥如下圖,。

分析流氏試劑的原理

Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白,，能與磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結(jié)合。將Annexin V 進(jìn)行熒光素（常用FITC,、PE或Biotin 標(biāo)記）,，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,。

碘化丙啶（propidine iodide,，PI）是一種核酸染料，特異性質(zhì)是不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,，PI 能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色，發(fā)紅光,。因此將Annexin V 與PI 匹配使用,，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及壞死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,，PS）活細(xì)胞中,，PS主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)測(cè)小葉如圖（2），當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激后,，PS通過(guò)依賴(lài)ATP主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制以及在ATP依賴(lài)的磷脂轉(zhuǎn)位酶的作用下從細(xì)胞膜的內(nèi)葉翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞表面,，從而暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，因其帶有磷酸基團(tuán)的負(fù)電,，從而被高親和力的Annexin V識(shí)別并結(jié)合,。

最后分析實(shí)驗(yàn)步驟

1.收樣。將細(xì)胞濃度控制為每管為106 個(gè)/ml,，取200 ul,， 1000 rpm×3 min。貼壁的細(xì)胞需用胰酶消化注意不含EDTA,。

2.PBS清洗2-3次,，1000 rpm×3 min離心。

3.將細(xì)胞重懸于100 ul binding buffer,，分別加入2 ul Annexin-V-FITC和PI,，輕輕混勻，避光37孵育箱上放置10分鐘,。

4.轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管,，每個(gè)樣品臨上機(jī)前加入400 ul左右PBS稀釋和過(guò)濾，30分鐘內(nèi)迅速檢測(cè),。

經(jīng)過(guò)反反復(fù)復(fù)對(duì)這四個(gè)方面進(jìn)行分析研究,，最后才總結(jié)出我的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，如下：

第一,，根據(jù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的概念分析,，細(xì)胞凋亡是程序性的過(guò)程,，我在加藥損傷等待細(xì)胞早期凋亡的時(shí)間上正好去捕捉到它的合理的百分比，是非常困難的,。因此在得到合理的百分比的時(shí)間我必須要做的實(shí)驗(yàn)是利用最簡(jiǎn)單的DAPI染色或者Hochest染色,，觀察加藥時(shí)間的時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞核的狀態(tài)變化，準(zhǔn)確判斷細(xì)胞早期凋亡發(fā)生的時(shí)間點(diǎn),；

第二,，根據(jù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流式試劑的原理分析，保證細(xì)胞膜的完整性,，Annexin V在早期凋亡才能染上,，因?yàn)樵缙?span style="color: rgb(62, 62, 62); font-size: 15px; background-color: rgb(255, 255, 255);">凋亡是染色在細(xì)胞膜上，因此可想而知,，如果細(xì)胞在收樣處理的時(shí)候,，細(xì)胞膜破損，那是一定染色不上去的,，所以盡可能的減少細(xì)胞膜的破損,，不用EDTA的胰酶消化和盡可能的等細(xì)胞邊緣變圓有脫落的時(shí)候再用槍頭吹打；

第三,，根據(jù)流式試劑和流式儀器分析,，細(xì)胞取樣時(shí)為了避免染色不上和堵塞流式進(jìn)樣管，必須將細(xì)胞消化清晰不可有粘附或者成團(tuán)抱在一起,，可在消化以后鏡下觀察（必須得進(jìn)行的操作）,；

第四，根據(jù)流式試劑的原理分析,，染色要避光,，Annexin V一般是標(biāo)記上的熒光，如FITC攜帶綠光,。而且染色的時(shí)候細(xì)胞內(nèi)buffer需要充分混勻,；

第五，根據(jù)流式儀器分析,，上機(jī)檢測(cè)之前,，盡可能在顯微鏡下觀測(cè)，細(xì)胞膜有沒(méi)有著綠色,，細(xì)胞核有沒(méi)有著紅色,，直接可以觀察到早期凋亡和壞死細(xì)胞，并且在有根據(jù)的情況下去上機(jī)檢測(cè),；

第六，根據(jù)流式儀器分析,，一般情況下需要設(shè)置組別如下表,，當(dāng)單陽(yáng)管染色不上,，補(bǔ)償調(diào)劑不好的時(shí)候需要與操作流式染色的工作人員溝通，是用活細(xì)胞做單陽(yáng)管染色,，還是處理過(guò)的細(xì)胞做單陽(yáng)管染色,，并調(diào)節(jié)補(bǔ)償，達(dá)到最理想的實(shí)驗(yàn)效果,。