細(xì)胞凋亡,,以前也稱細(xì)胞程序性死亡,,是指在一定的生理或者病理?xiàng)l件下,細(xì)胞主動(dòng)的,、高度有序的,、自己結(jié)束其生命的過(guò)程。細(xì)胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現(xiàn)象,,胚胎形成,、個(gè)體發(fā)育、衰老和損傷細(xì)胞的清除等都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),。檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法很多,,如電子顯微鏡或者光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察,、細(xì)胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實(shí)驗(yàn)等。而流式細(xì)胞術(shù)是非常重要的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法,,不僅可以定性,,也可以定量。 細(xì)胞凋亡可分為早期凋亡(細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,,磷酯酰絲氨酸外翻),、早中期凋亡(細(xì)胞質(zhì)密度增加,線粒體膜電位消失,,通透性改變,,釋放細(xì)胞色素c、到胞漿),、中晚期凋亡(細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)),、晚期凋亡(DNA降解為180-200bp片斷)。 細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)方法匯總:下面我們一一進(jìn)行介紹,。 一,、用的最多的Annexin V /PI雙染色法檢測(cè)早期凋亡 正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱的,活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面,,細(xì)胞凋亡時(shí),,細(xì)胞膜發(fā)生變化, PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面,。Annexin V是一種對(duì)PS有高度親和力的,、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,Annexin V可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS, 而活細(xì)胞的PS位千細(xì)胞膜的內(nèi)表面,,無(wú)法與Annexin V特異性結(jié)合,。所以可以用FITC偶聯(lián)的annexin V鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。 壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面,,Annexin V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS, 所以Annexin V無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,。而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合,區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞,。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整,, PI染料無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合,所以PI染料無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞,,而PI染料卻能夠通過(guò)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合,,壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光,被相應(yīng)通道接收,。所以Annexin V和PI同時(shí)使用,,就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞,。 操作方法(以懸浮細(xì)胞為例) 1,、細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)一定時(shí)間后,,收集細(xì)胞于1.5EP管中,4°C,,350g離心5min,,棄上清,用500ul預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,; 2,、分別加入5μl AnnexinV+5μlPI +95μl AnnexinV Bind Buffer(含鈣離子的緩沖液)重懸細(xì)胞,室溫,、避光20min; 3,、向每個(gè)管中加入200μl的AnnexinV Bind Buffer,盡快上機(jī)檢測(cè)。 4,、對(duì)照組的設(shè)置: (1)空白對(duì)照:誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加熒光劑,用來(lái)調(diào)電壓,; (2)單染對(duì)照:只加PI或AnnexinV(FITC),,用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償; (3)陽(yáng)性對(duì)照:誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光試劑,,確認(rèn)試劑,、儀器、操作沒(méi)有問(wèn)題,; (4)陰性對(duì)照:正常細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光試劑,,確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài),排除假陽(yáng)性,。 5,、上機(jī)操作時(shí)也是先調(diào)節(jié)電壓,再調(diào)節(jié)補(bǔ)償,。 結(jié)果分析 橫坐標(biāo)為AnnexinV強(qiáng)度,,縱坐標(biāo)為PI強(qiáng)度,對(duì)AnnexinV來(lái)說(shuō),,十字門(mén)左邊是陰性細(xì)胞群,,右邊是陽(yáng)性細(xì)胞群;對(duì)PI來(lái)說(shuō)十字門(mén)上邊是陽(yáng)性細(xì)胞群,,下邊是陰性細(xì)胞群,。 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) (1)貼壁細(xì)胞如何處理? 對(duì)于貼壁細(xì)胞,,凋亡染色,,用不含EDTA的0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液即可,其他參考懸浮細(xì)胞操作方法,,控制消化時(shí)間,,過(guò)渡消化會(huì)損傷細(xì)胞,。 (2)做流式凋亡是否需要調(diào)節(jié)補(bǔ)償? 如果使用的是相鄰?fù)ǖ赖臒晒馑?,要調(diào)節(jié)補(bǔ)償,。 (3)凍存過(guò)的細(xì)胞樣本,還可以做流式凋亡檢測(cè)嗎,? 不建議采用凍存過(guò)的細(xì)胞樣本,,盡量使用新鮮的樣本。 (4)保證細(xì)胞活性,,避免用力吹打,,預(yù)冷PBS清洗,縮短上機(jī)時(shí)間,,可上機(jī)前5min再加PI,; (5)血小板含有PS,能與AnnexinV結(jié)合,,故需除去 (6)結(jié)果分析需依據(jù)對(duì)照比較 二,、細(xì)胞凋亡---線粒體膜電位檢測(cè) JC-1是親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì),其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低,。正常生理狀態(tài)下,,線粒體負(fù)電性高,JC-1進(jìn)入線粒體以多聚體存在,,紅色熒光強(qiáng),,細(xì)胞凋亡時(shí),線粒體去極化產(chǎn)生,,負(fù)電性降低,,JC-1則以單體存在細(xì)胞質(zhì),綠色熒光增強(qiáng),。 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) (1)37°C 培養(yǎng)箱中孵育,; (2)JC-1工作液現(xiàn)配現(xiàn)用; (3)PH的變化影響膜電位,,保持平衡染液中PH的一致性,; (4)JC-1會(huì)與蛋白結(jié)合,降低燃料的濃度,,引起假去極化,; (5)用補(bǔ)償微球或借用FITC-PI的補(bǔ)償。 三,、細(xì)胞凋亡—活化的caspase-3檢測(cè) 活化的caspase-3由其前體裂解的一個(gè)17KD亞單位和一個(gè)12KD亞單位組成,,形成異二聚體,可被Anti-Active Caspase-3抗體特異性識(shí)別,。用熒光素標(biāo)記Anti-Active Caspase-3抗體即可檢測(cè)到活化的Caspase-3,。 實(shí)驗(yàn)流程(以懸浮細(xì)胞為例) 1,、細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)一定時(shí)間后,收集細(xì)胞于1.5EP管中,,4°C,,350g離心5min,棄上清,,用500ul預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,; 2、固定細(xì)胞,,洗滌之后加入破膜劑(破胞膜),; 3、加入熒光素標(biāo)記Anti-Active Caspase-3抗體,,進(jìn)行胞內(nèi)抗體染色,,室溫30min; 4,、加破膜劑洗滌之后,,F(xiàn)ACS buffer重懸細(xì)胞,流式上機(jī)檢測(cè),。 結(jié)果分析 橫坐標(biāo)為活化的Caspase-3強(qiáng)度,活化的Caspase-3陽(yáng)性的細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞(紅色部分),。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) (1)固定破膜之后細(xì)胞會(huì)損失,,前期可以多收集一些細(xì)胞。 四,、細(xì)胞凋亡—DNA片段化的檢測(cè) 細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180~200bp及其整數(shù)倍的寡核苷酸片段,,。DNA一旦發(fā)生片段化,在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)上會(huì)出現(xiàn)很多缺口,,可以使用FITC標(biāo)記的DUTP或BrdU在酶的作用下?lián)饺氲饺笨谥?,然后檢測(cè)摻入的信號(hào)強(qiáng)度,來(lái)判斷發(fā)生片段化的程度,。 實(shí)驗(yàn)流程:跟上面提到的步驟差不多,,在此不做贅述。 固定-洗滌-FITC-dUTP染色-洗滌-PI/Rnase染色-上機(jī)檢測(cè) 結(jié)果分析 橫坐標(biāo)為DNA含量,,縱坐標(biāo)為Brdu強(qiáng)度,,Brdu陽(yáng)性的細(xì)胞即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。 |
|