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磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3).Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合.將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC,、PE)或biotin標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生. 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染.因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái). 方法 1 懸浮細(xì)胞的染色:將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室溫避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反應(yīng)5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)(一般不超過(guò)1h), 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照. 2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗滌,、染色和分析同懸浮細(xì)胞. 3 爬片細(xì)胞染色:同上,最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察. 結(jié)果 [圖3,、圖4,、圖5]
注意事項(xiàng)
原文見(jiàn)：http://www.dxy.cn/bbs/topic/189335 |
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來(lái)自： bigaunt1994 > 《流氏》
