PCR貼著三個(gè)標(biāo)簽：基礎(chǔ),、簡單、小白,。那么問題來了,，PCR真的如此簡單嗎？在網(wǎng)絡(luò)上,，一共有25萬條的信息是關(guān)于“PCR為什么”,，為什么PCR做不出來？為什么PCR要設(shè)溫蓋,？為什么PCR重復(fù)不了…….這個(gè)簡單的技術(shù)看來難倒了不少同志,。作為一個(gè)浸淫PCR多年耗盡無數(shù)MIX的老鳥，且聽我娓娓道來個(gè)中原因：

我們都知道,，現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室做PCR都是直接用的Premix,，配制體系非常快捷方便,，基本實(shí)現(xiàn)了傻瓜式操作,。

然而，在許多人在暢享Premix的方便時(shí),，同樣多的人沉淪在P不出來的痛苦中,！如下圖這位同學(xué)。當(dāng)然,，下面這位同學(xué)純屬倒霉,，買到垃圾Mix，如果你遇到了,，請(qǐng)私信筆者,，給你發(fā)個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)紅包。

更多的問題是什么呢,？是體系的成分問題,。我們知道一個(gè)Premix 已經(jīng)包含了PCR反應(yīng)所需要的Mg2+，Buffer,，酶,，dNTPs等成分。而這些成分隨著不同的模板和反應(yīng)所需要的量并不都是固定的,。這也就是導(dǎo)致了很多人同樣廠家的產(chǎn)品P不同的基因,，A基因可以完美P出來,，而B基因卻死活P不出來，甚至即使P出來結(jié)果也很差,。如下左圖,，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶,；亦或下右圖的拖尾現(xiàn)象。

這些情況很可能就是因?yàn)镻remix中酶量過多或者M(jìn)g2+濃度偏高,。這時(shí)候就要考慮適當(dāng)加大稀釋倍數(shù),。當(dāng)然，作為一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng),，在PCR反應(yīng)過程中我們可能遇到各式各樣難以（奇）解釋（葩）的問題,。筆者所舉例子并不能涵蓋大家平時(shí)遇到的所有問題，僅僅拋磚引玉提供了解決分析問題的角度給大家來參考,，下同,。

PCR諸般問題，Mix獨(dú)占三分,。倘若在百P不出而你又實(shí)在找不到原因,，那就要回頭認(rèn)真考慮下Mix組分的問題。有人要問了Mix都占據(jù)了三分呢,？那剩下的是不是就是模板和引物了,。這個(gè)對(duì)也不對(duì)，在這個(gè)引物設(shè)計(jì)都實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化（公司,，軟件都可以代勞）的年代,，引物對(duì)于PCR結(jié)果的影響幾乎不存在,，如果有,，那么呵呵呵，歡迎百度“PCR引物設(shè)計(jì)入門指南”,。

但是,，qPCR不在這個(gè)隨意的范圍內(nèi)，由于qPCR對(duì)引物的高質(zhì)量要求使得我們隨便不得,，稍微不注意便會(huì)使得反應(yīng)的特異性下降從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,。那么剩下的只有模板可選了，模板的添加問題可能很多人忽略,，往往隨便加點(diǎn)就行了,。大多數(shù)時(shí)候這樣沒毛病，完全P的出來,，但是,，倘若你剛好就遇到了那少數(shù)P不出來的時(shí)候，那就可能百思而不得其解了。

我們先來看看PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的模板要求是什么,？下圖引用了某廠家PCR mix說明書的參考量：

從圖中我們可以看出不同類型模板所添加的質(zhì)量是不一樣的,，而過量或者過少的模板量都極有可能導(dǎo)致P不出來，所以這是我們第一個(gè)要注意的,。

此外,，我們的目的基因都由AGCT四種堿基組成，大多時(shí)候我們的模板里的四種堿基并不是均勻分布的,，一般我們認(rèn)為GC含量40-60%之間是正常的模板,。而如果不巧你的模板就是高于這個(gè)含量或者低于這個(gè)含量，我們稱之為“富含GC或AT模板”,。這個(gè)也是導(dǎo)致很多PCR或者測(cè)序失敗的重要原因,。面對(duì)這種情況，土豪實(shí)驗(yàn)室的user們可以購置各廠家專為這類模板設(shè)計(jì)的PCR專用Mix或者Buffer,；那屌絲實(shí)驗(yàn)室是不是就只能望P興嘆,，毫無辦法呢？你都看到這里了,，答案當(dāng)然是No,，既然我們實(shí)現(xiàn)不了自動(dòng)化的一步到位（燒錢），就只好手動(dòng)慢慢來了,。在這種情況下,，我們可以通過添加各類的PCR增強(qiáng)劑來實(shí)現(xiàn)一樣的效果，常用的增強(qiáng)劑如下圖,。

如面對(duì)富含GC的模板,，我們可以通過添加適量的DMSO來達(dá)到與土豪專用GC專用Buffer一樣的效果（似乎暴露了屌絲的本質(zhì)）。所以在走投無路P無可P的時(shí)候善用這些增強(qiáng)劑有時(shí)候能達(dá)到奇效,。

最后就是上機(jī)程序的問題,，這個(gè)問題說大也大，說小也小,，請(qǐng)認(rèn)真閱讀PCR mix的說明書,，嚴(yán)格按照操作來進(jìn)行。同時(shí),，適當(dāng)調(diào)整退火溫度,，僅此而已。

幸福的PCR都是相似的,，不幸的PCR各有各的不幸,。人都有一個(gè)習(xí)慣，越是熟悉越容易看到的東西,，越容易被忽略,。PCR雖說并不是個(gè)復(fù)雜的過程,，但經(jīng)常會(huì)因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)性的熟悉而遇到各種各樣棘手的問題，有的甚至能卡在這一步兩三個(gè)月之多簡直是令人痛心疾首,。好了,，今天就策到這里，希望對(duì)大家有幫助,。