首先，為了對腫瘤轉移模型有更加清晰的理解,，我們先來了解一下,，腫瘤轉移的過程。

一,、腫瘤轉移過程

腫瘤細胞的轉移過程（如圖1）：原位侵襲（Local invasion）,，腫瘤細胞內(nèi)滲（Intravasation），循環(huán)系統(tǒng)存活（Survival in the circulation）,，腫瘤細胞外滲（Extravasation）,，形成轉移灶（Micrometastasis formation）等過程[1]。

圖1.腫瘤轉移的基本過程

可以形象地解釋如下：

第一步：離家出走,；腫瘤細胞在原位侵襲,，離開原發(fā)灶，內(nèi)滲進入血管,、淋巴管,，進而獲得血液提供的營養(yǎng)；

第二步：絕處逢生,；進入血液循環(huán)系統(tǒng)后,，作為一個異己分子，逃避機體免疫系統(tǒng),，最終較少的腫瘤細胞成功存活,；

第三步：鳩占鵲巢,；在適合生存的環(huán)境開始生長，并從循環(huán)系統(tǒng)滲出,，到新的組織器官增殖并形成轉移灶,；

第四步：繁衍生息；新環(huán)境生存穩(wěn)定后,，腫瘤細胞打敗了原有的住戶，逐漸增殖擴大同時,，又計劃轉移到其他器官,。

二、常用的腫瘤轉移模型

一般根據(jù)腫瘤細胞接種方式,，主要分為以下幾種轉移模型：

1. 尾靜脈注射  

腫瘤細胞經(jīng)尾靜脈注射后,，先通過肺部的毛細血管網(wǎng)進入動脈血液循環(huán)系統(tǒng)，可造成全身多發(fā)轉移灶,。但是由于腫瘤細胞較為粘稠易聚團,，一般會被困在小鼠肺部微血管，主要形成肺轉移,，可能后期會造成遠端器官的轉移,。主要用于建立腫瘤轉移（血行通路）模型或血癌模型或者腫瘤肺轉移。

2. 左心室注射 

腫瘤細胞經(jīng)過左心室注射進入小鼠體循環(huán),，細胞經(jīng)過粘附,，降解及遷移等過程，最終造成不同器官的轉移,，可以很好的模擬腫瘤的血道轉移過程,。一般多造成骨、腦等部位轉移,。

3. 原位注射 

將腫瘤細胞移植于小鼠相應器官,，如人乳腺癌細胞移植到裸鼠乳房墊上，人的肝癌移植到裸鼠肝葉上,。該模型可模擬轉移的全過程,，包括最初侵襲組織，穿入血管和形成轉移灶等步驟,，更加接近人類腫瘤轉移的過程,。因此原位模型廣泛用于抑制腫瘤轉移和生長的藥物篩選。

4. 腹腔注射

將腫瘤細胞注射到小鼠腹腔,，操作簡單,，可出現(xiàn)一定比例的浸潤、轉移和腹水,。主要是觀察腫瘤細胞在腹腔內(nèi)的轉移情況,，但是腹腔血液循環(huán)相對較少,，不利于腫瘤轉移的發(fā)生，適合某些腫瘤轉移過程,，如卵巢癌,。

5. 其他注射方式 

除了上面常見的幾種轉移模型，還有用到的如：爪墊皮下移植（因爪墊皮下有豐富的淋巴管,，可研究淋巴道轉移）,；腎包膜（腎包膜血管豐富，可立即供給移植腫瘤充分的氧及營養(yǎng)）,；脾臟注射（可造成肝轉移模型）等,。

在上述的轉移模型中，我們一般是根據(jù)腫瘤類型和研究目的,，選擇最適合模型,，如研究乳腺癌轉移過程，我們查詢文獻發(fā)現(xiàn)乳腺癌易轉移到骨,、肺部,，因此如果想研究乳腺癌的轉移后期階段的著床、生長,、血管生成等及腫瘤轉移的藥物的篩選檢測等,，會選擇尾靜脈注射和左心室注射模型。如果想研究腫瘤轉移全過程,，并研究抗腫瘤增殖和轉移的藥物篩選,，我們會選擇原位移植模型。

本期主要介紹前2種腫瘤轉移模型：左心室注射和尾靜脈注射的構建過程,。

三,、2種轉移模型的建立

細胞系和小鼠的準備：

如上期的皮下荷瘤模型基本一致，首先是需要選擇合適的細胞系和小鼠,，需要注意的是：

（1）細胞系的選擇：選擇臨床中侵襲性強的癌細胞,。同時，由于體內(nèi)轉移不易監(jiān)測,，所以可構建帶有熒光素酶（Luciferase）標簽的細胞(如MDA-MB-231-luc,，CT-26-Luc)，利用熒光素酶與熒光素作用時生物發(fā)光的原理,，在IVIS小動物活體光學成像系統(tǒng)上更直觀地檢測原位腫瘤細胞向內(nèi)臟器官的轉移情況,。

（2）細胞接種量及稀釋：每只小鼠注射100μL左右，1×10⁵個細胞（注入到血液的細胞相比皮下少,，因為細胞聚團易堵住血管,，造成小鼠死亡）。

（3）其他準備器材：注射器，冰盒,、麻醉劑阿佛丁,，注射器，75%酒精棉球,，手術保溫機,。

（一）尾靜脈注射

1. 尾靜脈注射步驟

我們在往期具體介紹過，可參考1.7 尾靜脈注射實驗技巧,；

尾靜脈注射步驟視頻：

2. 后續(xù)分組與實驗分析

在注射細胞當天,，利用IVIS活體成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)的腫瘤細胞，根據(jù)讀值進行分組,，一般每組準備10只小鼠,，因為小鼠會發(fā)生死亡，所以至少保證可獲得每組5個數(shù)據(jù),。可分為對照組,，陽性藥物組,，低劑量，中劑量和高劑量藥物處理組,，當天給藥,。

如下圖為，尾靜脈注射腺癌細胞MDA-MB231-luc后,，利用IVIS監(jiān)測腫瘤轉移,，可看到癌細胞主要發(fā)生在肺部[2]。

圖2. 尾靜脈注射后IVIS 監(jiān)測腫瘤細胞的轉移

（二）左心室注射

1. 注射步驟

①  裸鼠經(jīng)麻醉,、仰臥式固定,、酒精棉球消毒；

②  輕按胸部,，在胸骨左側第二,，三肋間進針（靠近胸骨），注射器內(nèi)留有氣泡時,，針頭進入左心室,；

③  進針3-5mm，以觀察到鮮紅血液噴射涌出進入針管,，回血液面隨著裸鼠心率搏動上下起伏,，作為進入左心室的標準；

④注射,，在10s 內(nèi)完成,；

⑤注射完畢后緩慢拔針，棉簽按壓進針點；

⑥裸鼠放置保溫臺待蘇醒,；

⑦接種后的裸鼠置于SPF環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng),，并密切觀察。

注射時的注意事項：

1. 注射到左心室的標準是什么,？

針頭有鮮紅色血柱噴出,，因為左心室為動脈血，血色鮮紅,，心肌有力,，所以針頭進左心室后，會有鮮紅色血柱噴出,。如為暗紅色血,，進入的為左心房，建議進針位置下移,。

動圖1

2. 如果沒有看到血絲是什么原因,，該如何處理？

 如果針頭未進入心室,，只進入心肌層或胸腔,，則無血溢出。建議在附近調(diào)整進針位置,。

3. 小鼠扎針后流血怎么辦,？

如果進針創(chuàng)口過大，可能造成小鼠血流不止,，因此要小心操作,；如果血流不止，建議直接處死小鼠,，不建議進行試驗,。

左心室注射步驟視頻

2. 后續(xù)分組和數(shù)據(jù)分析

如尾靜脈實驗一致，注射當天就可根據(jù)IVIS結果進行分組,，當天或者隔天給藥,。同樣分為對照組，陽性藥物組,，低劑量,，中劑量和高劑量藥物處理組（n=10）。

如下圖為,，左心室注射MDA-MB231-luc 乳腺癌細胞后,，利用IVIS 監(jiān)測腫瘤轉移，可看到主要在骨和腦部有癌細胞,，并結合拍X光分析乳腺癌轉移導致的溶骨現(xiàn)象[3],。

圖3. 左心室注射后IVIS 監(jiān)測腫瘤細胞的轉移（上）X光拍攝的溶骨現(xiàn)象（下）

注意：由于以上二者模型均是直接將腫瘤細胞注入血液，進入小鼠血液循環(huán)，會對小鼠機體正常代謝影響較大,，因此必須密切觀察,，并定期稱重，當裸鼠體重減輕20%或者低于16g 時,，或出現(xiàn)嗜睡,、行動遲緩、呼吸短促,、食欲下降等異樣癥狀是,，需要結束實驗，安樂處死小鼠,。

本期就先為大家介紹這2個腫瘤轉移的動物模型,，與皮下荷瘤相比，轉移模型構建難度明顯加大,，但也是我們經(jīng)常用到的藥物篩選模型,；與尾靜脈注射相比，左心室注射難度會更大,，需要自己奪多花功夫摸索,。下一期，我們會繼續(xù)為大家提供另外的腫瘤轉移模型的構建,，大家持續(xù)關注哦！

視頻提供者：孟云

參考文獻：

1. Valastyan S, Weinberg R A. Tumor Metastasis: Molecular Insights and Evolving Paradigms[J]. Cell, 2011, 147(2): 275-292.

2. Zhang T, Li J, Dong Y, et al. Cucurbitacin E inhibits breast tumor metastasis by suppressing cell migration and invasion.[J]. Breast Cancer Research and Treatment, 2012, 135(2): 445-458.

3. Wang J, Zhang L, Chen G, et al. Small molecule 1’-acetoxychavicol acetate suppresses breast tumor metastasis by regulating the SHP-1/STAT3/MMPs signaling pathway[J]. Breast Cancer Research and Treatment, 2014, 148(2): 279-289.