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在慢病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)用流程(一)中,，我們學(xué)習(xí)了利用目的基因包裝成慢病毒感染細(xì)胞的原理,，今天就和醫(yī)學(xué)方小編學(xué)習(xí)具體如何操作。 質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒（病毒包裝） 293T細(xì)胞是由293細(xì)胞派生, 表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系, 被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過表達(dá)各種目標(biāo)蛋白, 或是用以包裝病毒,。 脂質(zhì)體：某些細(xì)胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體,，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質(zhì)后更有效地運(yùn)送到靶細(xì)胞,，經(jīng)同細(xì)胞融合而釋放,。 小編將以293T細(xì)胞包裝慢病毒，感染10cm SW480結(jié)腸癌細(xì)胞為例： DAY1 轉(zhuǎn)染前一天,，用1ml胰酶消化293T細(xì)胞1-2分鐘,，用含10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基重懸293T細(xì)胞，鋪2-3*106個(gè)細(xì)胞至 10cm dish中(70-80% 融合度),；(注：慢病毒包裝時(shí)要多種一點(diǎn)兒293T細(xì)胞,，慢病毒對(duì)細(xì)胞的毒性較大！) DAY2 （轉(zhuǎn)染時(shí)準(zhǔn)備無雙抗完全培養(yǎng)基，抗生素對(duì)轉(zhuǎn)染中細(xì)胞損傷大） 1,、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(10cm dish)： A：用470ul optimem稀釋30ul Fugene 9（其他轉(zhuǎn)染試劑比例詳見其說明書）, 并充分輕輕地混勻,，室溫下靜置5 min B：準(zhǔn)備 target plasmid 和 包裝載體plasmid： pCMV8.9/ psPAX2：3.33ug （注：10cm dish 的量） PMD.G / pMD2.G：1.67ug （注：10cm dish 的量） Target plasmid ： 5ug（注：這3個(gè)質(zhì)粒都加在同一個(gè)EP管中） 六孔板的量是： pCMV8.9/ psPAX2： 1ug PMD.G / pMD2.G： 0.5ug Target plasmid ： 1ug C：將上述準(zhǔn)備的質(zhì)粒混合液滴加到optimem與Fugene 9的混合液中 ,，RT ,靜置20min,； 2、6-8h后對(duì)293T細(xì)胞換液,，注意加液時(shí),，不要吹起細(xì)胞（沿著皿壁，輕輕地加新培液）,；置37°細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h,；-----隨后同時(shí)做SW480細(xì)胞的鋪板（見后）。 DAY3 SW480細(xì)胞的鋪板：目的細(xì)胞SW480,，需要提前一天鋪板至10cm dish中（10cm dish SW480細(xì)胞接種個(gè)數(shù)是1*106個(gè),，六孔板大約2—3*105個(gè)），以保證感染時(shí)的密度為30~40%,；同時(shí)準(zhǔn)備一個(gè)對(duì)照組10cm dish細(xì)胞,，不感染病毒（注：SW480細(xì)胞比較難消化，貼壁比較牢,，得放在培養(yǎng)箱中消化4min）。第二天棄上清液,。 DAY4 慢病毒液的收集：轉(zhuǎn)染48h 后（此時(shí)293T長滿）,，收集上清液于15ml 離心管中，3000rpm離心20min,，將上清液用0.45um濾頭過濾,。再向10cm dish 加10ml培液，24h之后,，可以再次收集上清液,，按照每次用量分裝，保存于-80°冰箱中,。(如果病毒液暫時(shí)不用,，可以置-80°冰箱中避光保存，千萬不能反復(fù)凍融),?？梢赃x擇用濃縮管濃縮。 慢病毒感染目的細(xì)胞SW480： 1,、配置3ml 培養(yǎng)基1640 (10%FBS), 然后加入3ml 病毒上清液(剩余的病毒上清液放-80冰箱中保存), 24h之后補(bǔ)加4ml 1640培養(yǎng)液,，為了保證細(xì)胞處于良好狀態(tài)； 2、10cm dish置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24h,；-------（如果目的基因帶有GFP標(biāo)簽,，72h之后可以通過熒光顯微鏡看感染情況）； 3,、48h后,，棄上清，更換新鮮培養(yǎng)基6~8ml,，并加入相應(yīng)濃度藥物篩選（G418或者嘌呤霉素）,； 4、篩選2-3天之后,，觀察dish中細(xì)胞生長的狀況,，不感染病毒的對(duì)照組細(xì)胞應(yīng)該全部死光，而感染病毒的細(xì)胞存活率較高,；也可通過觀察GFP的亮度,判斷篩選是否成功,，隨后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。 |
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