實(shí)驗步驟

一、桿狀病毒表達(dá)載體

最簡單的經(jīng)典桿狀病毒表達(dá)載體是一個重組的桿狀病毒,，其基因組含有一段外源核酸序列,，通常為編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dDNA,，在多角體蛋白啟動子控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這個嵌合的基因由多角體蛋白啟動子和外源蛋白編碼序列組成,，其位于病毒基因組多角體座位,，替代了非必需的野生型多角體基因。在實(shí)驗室中,，重組病毒能夠感染昆蟲細(xì)胞或幼蟲(毛蟲）,，這會使外源cDNA在感染的極晚期出現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄出的mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì),。多角體蛋白啟動子似乎總是可以在轉(zhuǎn)錄水平上驅(qū)動極高水平的外源基因表達(dá),，在很多時候可以獲得大量的外源蛋白, 就像最初推測桿狀病毒能夠制造出大量的多角體蛋白那樣。確實(shí)是這樣,，具有高水平表達(dá)重組蛋白的潛能是桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的一個主要優(yōu)點(diǎn),。在此, 高水平的含義非常寬泛，是指每升感染桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物或4 g昆蟲細(xì)胞(通常細(xì)胞密度為 1X106 個細(xì)胞/mL)產(chǎn)出大于或等于100 mg的重組蛋白,。此外,，在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)很少形成包涵體，而包涵體常常在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中形成,。任何從事重組蛋白生產(chǎn)的研究人員都清楚,，在任何表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)可以達(dá)到的產(chǎn)量和可溶水平很大程度上取決于所研究的蛋白質(zhì)本身。因此, 從25年的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使用經(jīng)驗得出的結(jié)論是: 與分泌蛋白相比,，該表達(dá)系統(tǒng)更易獲得細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白的高表達(dá),。前者的表達(dá)水平較后者要低, 通常只有每升幾毫克到十幾毫克 (Jarvis,1997)。

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的另一個優(yōu)點(diǎn)是具有真核蛋白的加工能力, 包括對蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化或糖基化等的修飾能力,。但是,，這種觀點(diǎn)有一定的局限，現(xiàn)在已經(jīng)很清楚地認(rèn)識到,，桿狀病毒的鱗翅類昆蟲細(xì)胞宿主的蛋白質(zhì)加工與更高等的真核細(xì)胞不同,。另外的困擾是桿狀病毒的感染對宿主蛋白質(zhì)加工有負(fù)面的影響（Azzouzetal.,2000;JarvisandSummers，1989),。顯然,，對于任何有興趣生產(chǎn)需要進(jìn)行真核修飾的重組蛋白的研究者來說，特別是已知這種修飾直接或間接的影響功能,，這些都是需要重點(diǎn)考慮的因素,。

最后指出的是，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)已被證明對多蛋白質(zhì)亞基復(fù)合物(multiproteinsubunitcomplexe) 的生產(chǎn)非常有用[參考Berger等 (2004);Kost等（2005) 的綜述],。

該系統(tǒng)能夠產(chǎn)生由多組分構(gòu)成的病毒顆粒,，這樣的病毒顆粒是極好的候選疫苗，這體現(xiàn)了該系統(tǒng)在此重要應(yīng)用領(lǐng)域的強(qiáng)大功能。例如,，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)已經(jīng)用來生產(chǎn)由脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus),、藍(lán)舌病毒（bluetonguevirus)、腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus),、丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus) 和乳頭瘤病毒（papillomavirus)來源的多種蛋白質(zhì)組成的病毒樣顆粒,。該病毒樣顆粒的產(chǎn)生可以通過構(gòu)建多個表達(dá)單一蛋白質(zhì)的重組病毒來實(shí)現(xiàn)，或者構(gòu)建一個能夠編碼多個重組蛋白的單一病毒去感染昆蟲細(xì)胞,。

二,、桿狀病毒表達(dá)載體技術(shù)一早期

如前所述，利用基本的同源重組原理,，構(gòu)建了第一個重組的桿狀病毒載體用于表達(dá)由多角體蛋白啟動子和外源編碼序列組成的嵌合基因,。該方法的詳細(xì)技術(shù)可以參考本書的第一版(Bradley,1990), 也可以參考原作者發(fā)表的主要論文及其編寫的優(yōu)秀的技術(shù)手冊(O’reillyetal.，1992;SummersandSmith,，1987),。因此，和上面一’樣,，這部分在此不再贊述,。但是，為了對背景有所了解, 對此進(jìn)行簡短地介紹還是很重要的,。該常用的方法涉及:

①構(gòu)建具有嵌合基因的細(xì)菌轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,，該嵌合基因具有來源于病毒基因組多角體區(qū)域的側(cè)翼序列（圖I4.1);

②使用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與從純化的野生型AcMNPV提取的基因組 DNA 的混合物共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞（圖14.2)。

在共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中,，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與AcMNPV基因組通過同源重組產(chǎn)生重組病毒 DNA 分子,，該同源重組發(fā)生在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上的目的嵌合基因側(cè)翼序列與病毒基因組多角體蛋白基因的上游和下游序列之間。為了在敲除(knockout)多角體蛋白基因的同時敲人(knock-in) 編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的嵌合基因,，這必須是一個發(fā)生了雙交換的重組(doublecrossoverrecombination),。當(dāng)然，這種重組的發(fā)生率相對較低,，估計在 0.1% 左右(Smithetal.,，1983a)。因此, 必須將少數(shù)重組病毒的子代病毒從共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的大量的親代病毒的子代病毒中分離出來. 通過桿狀病毒空斑實(shí)驗可以很容易地完成分離, 但是研究人員要能夠從大量的親代病毒產(chǎn)生的空斑中辨別出重組病毒形成的空斑,。最初,，可以通過簡單的肉眼篩選來進(jìn)行辨別, 因為來自親本的子代病毒形成的為多角體蛋白陽性的空斑, 而重組體子代病毒由于缺少表達(dá)多角體蛋白的基因，所以呈現(xiàn)多角體蛋白陰性的空斑,。經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員能夠在解剖顯微鏡下通過觀察實(shí)驗平板鑒定出多角體蛋白陰性的空斑,。因此, 有這種辨別能力是篩選成功的關(guān)鍵。多年來,，許多研究人員不具有識別多角體蛋白陰性的桿狀病毒空斑的能力,，這是一個非常嚴(yán)重的問題,，它制約著桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)作為表達(dá)重組蛋白生產(chǎn)工具的應(yīng)用。

三,、桿狀病毒表達(dá)載體技術(shù)—-改進(jìn)

從1卯0年左右開始,，研究人員開始克服了桿狀病毒載體分離方面的技術(shù)局限,，并且通過對上述基本方法的大量改動,，在別的方面對該系統(tǒng)也進(jìn)行了改進(jìn)。這些改進(jìn)可以分為兩類: 一類是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的改進(jìn); 另一類是親代桿狀病毒基因組的改進(jìn),。下面對它們分別進(jìn)行介紹,。

四、桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的改進(jìn)

對轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行了改進(jìn)是出于兩個不同的目的,。最重要的目的是使通過肉眼篩選鑒定重組桿狀病毒空斑變得簡單,，從上面描述的原因可知這曾經(jīng)很難。通常的一種此類改進(jìn)方法是引人在桿狀病毒啟動子控制下的嵌合標(biāo)記基因,。例如,，大腸桿菌的/3-半乳糖苷酶蛋白與多角體陰性空斑表型相比，對它的肉眼識別更加容易（Vialardetal.,，1990),。

在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中引人標(biāo)記基因是聰明的做法，但也應(yīng)該注意到該種改進(jìn)方法存在的潛在問題（O’reillyetal.,，1992),。弓丨人的標(biāo)記基因不僅能夠作為所需要的雙交換同源重組的信號，也能夠作為在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和病毒 DNA之間產(chǎn)生的單交換同源重組(singlecrossoverrecombination) 的信號,。單交換重組的發(fā)生概率很高,，所產(chǎn)生的重組病毒的基因組包含了細(xì)菌復(fù)制子在內(nèi)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的全部序列，而且整合位點(diǎn)有一定的隨機(jī)性,。這些重組體在遺傳上是不穩(wěn)定的, 新獲得的外源基因可能會在 1~2輪的病毒復(fù)制中丟失,。盡管有很大的局限性, 能將標(biāo)記基因引入重組病毒基因組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒還是被廣泛使用, 對于那些清楚知道潛在的單交換重組陷阱的研究人員來說, 它們尤其有用,。他們只是使用標(biāo)記基因進(jìn)行初篩, 然后通過進(jìn)一步篩選來確定外源基因在基因組中的整合位點(diǎn),，最后確定是否是雙交換重組將目的基因轉(zhuǎn)移到了重組桿狀病毒載體。

對轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行改進(jìn)的第二個目的是方便重組蛋白在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)與純化,。這種改進(jìn)的數(shù)量太多因而不能在此逐一討論, 有3 種通常的改進(jìn)屬于此類,，它們包括引人信號肽的編碼序列; 在蛋白質(zhì)的N端或C端引入純化標(biāo)簽的序列（如His6); 將多角體蛋白啟動子替換為別的桿狀病毒啟動子, 或者使用多個啟動子元件替換多角體蛋白啟動子，這樣就可以在桿狀病毒感染時同時表達(dá)多個重組體蛋白,。

最近的一個出版物列出了幾乎所有的經(jīng)過上述兩類改進(jìn)的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,，并且簡短描述了它們功能上的特色，它是該領(lǐng)域一個很好的信息來源（PosseeandKing,2007),。但是,，有一類改進(jìn)并未列出但值得進(jìn)一步的關(guān)注,，它們是即刻早期（immediate^early)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，在這些質(zhì)粒中,，多角體啟動子被替換為桿狀病毒即刻早期基因的啟動子,，如AcMNPV的iel基因 (Jarvisetal.，1996),。使用來自桿狀病毒早期基因的啟動子 (如iel基因)似乎違反之前提及的原則,，因為這些啟動子比多角體蛋白啟動子弱。但是,，有一些證據(jù)可以表明,，在早期啟動子控制下重組桿狀病毒表達(dá)外源基因可以獲得更高質(zhì)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，盡管這些早期啟動子不能啟動同樣高水平的轉(zhuǎn)錄（ChazenbalkandRapoport,1995,；Hill-PerkinsandPossee,1990,；Jarvisetal.,1996；Murphyetal.,1990;Rankletal.,，1994;SridharetaUW93),。事實(shí)上，這個方法尤其適用于分泌蛋白,。如上所述,，這些蛋白質(zhì)在多角體蛋白啟動子控制下通常是低水平的表達(dá)。在這種情況下, 研究人員或許能夠利用這種在感染較早期進(jìn)行外源基因表達(dá)的好處, 從而避免桿狀病毒感染對宿主蛋白加工途徑帶來的負(fù)面作用,，同時也能夠獲得高水平表達(dá)的產(chǎn)物,。

五、親代桿狀病毒基因組的改進(jìn)

就像轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的改進(jìn),，對親代桿狀病毒基因組的改進(jìn)也是為了滿足各種不同的需要,。

起初，最主要的目的是找到克服重組桿狀病毒載體構(gòu)建和分離低效率的方法,，這也是最初的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)存在的主要問題?，F(xiàn)在已經(jīng)知道這個問題的根源在于, 在共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和親代桿狀病毒 DNA 的同源重組效率很低,。最終,，研究人員想出了一些直接和間接的方法來解決這個難題。

Kitts 和Possee構(gòu)建出具有線性DNA基因組的桿狀病毒,，向問題的解決邁出了重要的第一步（Kittsetal.,，1990)。這種病毒是通過最初的同源重組方法獲得的重組桿狀病毒,，其主要特點(diǎn)是在多角體蛋白基因座位有一段新的 DNA序列,，該序列具有Bw36I的酶切位點(diǎn)(圖14.3)。因此, 該基因組能夠被5似361線性化并作為親代病毒 DNA與轉(zhuǎn)移質(zhì)?；旌虾蠊厕D(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,。這種方法最大的特點(diǎn)是線狀的親代病毒 DNA分子不會復(fù)制,。因此，線性化在很大程度上減少了共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞中親本子代的數(shù)量,。另外,，線狀病毒DNA仍然可以與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，重組后病毒DNA分子重新形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并恢復(fù)復(fù)制能力,。這些因素加起來,，使得共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中重組桿狀病毒載體的產(chǎn)生效率從0.1% 增加到10%~20%，也使該技術(shù)得到了極大的簡化,。Kitts和Possee對該方法做了改進(jìn),，他們構(gòu)建了一個稱為BakPAK6的重組桿狀病毒，該病毒可以被Bm36I切開,。BakPAK6基因組具有一個位于多角體蛋白基因座位的大腸桿菌^cZ基因，該基因內(nèi)有一個B361位點(diǎn),，另外還在病毒基因的上游和下游分別引入一個Bsw36I位點(diǎn)(圖14.4),。重要的是，經(jīng)過&M36I的消化,，or/1629 的一部分被刪除,，w/1629是病毒的一個必需基因，它位于多角體基因的下游,，編碼了病毒核衣殼的鱗蛋白（nucleocapsidphosphoprotein)(VialardandRichardson,1993),。將BakPAK6作為親代病毒DNA，通過共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的方法構(gòu)建重組桿狀病毒載體的效率增加到95%,。BakPAK6的成功刺激了多種線性化的桿狀病毒DNA的商業(yè)化和廣泛應(yīng)用,。它們被用做構(gòu)建重組桿狀病毒載體的起始材料。這些商業(yè)化的桿狀病毒DNA中,，最主要的包括ClonTech商業(yè)化的原始的 BakPAK6病毒DNA,。類似的還有預(yù)線性化的稱為BaculoGold的病毒DNA(Pharmingen/BDBiosciences)、Novagend的 BacVector,、Sigma-Aldrich的 Diamond-Bac,。此外，一個稱為BaoN-BIue(Invitrogen)的是經(jīng)過輕微改進(jìn)的線性化病毒DNA/轉(zhuǎn)移質(zhì)粒系統(tǒng), 重組后, 其基因組內(nèi)的大腸桿菌標(biāo)志物會得到重建,。

在本章的此處,，強(qiáng)調(diào)這些病毒DNA骨架的發(fā)展是很重要的，它們有效地解決了本書第一版出版時在構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體時存在的主要問題,。這些線狀的桿狀病毒DNA被商業(yè)公司廣泛的市場化并且很快就被生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)承認(rèn)和接受,，作為重組桿狀病毒構(gòu)建的改良工具。這些工具和方法 (見下面相關(guān)內(nèi)容)的出現(xiàn)讓具有基礎(chǔ)分子生物學(xué)背景的實(shí)驗室普通研究人員能夠更容易地運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)載體,。最終,，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)得到了更廣泛地應(yīng)用,，并且作為重組蛋白制備的有效工具得到了普遍地認(rèn)可。

與此同時,，Luckow和他的同事們發(fā)展了一種與線性化病毒基因組不同的方法來分離桿狀病毒載體,。他們的方法利用了遺傳轉(zhuǎn)座(genetictransposition), 而不是同源重組(LuckowetaL,1993)。該方法通過使用不同的分子機(jī)制來產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA從而使研究人員解決了同源重組的低效問題,。該方法的關(guān)鍵在于構(gòu)建一個新的大腸桿菌菌株, 該菌株具有一個包含完整桿狀病毒基因組拷貝的能夠自主復(fù)制的質(zhì)粒, 或稱桿粒(bacmid)(圖14.5),。桿粒的多角體蛋白區(qū)域包含大腸桿菌ZacZ基因和mini-AttTn7位點(diǎn)，它是轉(zhuǎn)座的附著位點(diǎn)（attachmentsite),。這株新構(gòu)建的大腸桿菌菌株還有一個編碼轉(zhuǎn)座酶(transposase)的輔助質(zhì)粒,。使用桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該新型大腸桿菌菌株，由于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上的多角體驅(qū)動的目標(biāo)基因的側(cè)翼序列為Tn7附著位點(diǎn)的左端和右端, 該嵌合基因會轉(zhuǎn)座至桿粒上的多角體區(qū)域,。轉(zhuǎn)座時會導(dǎo)致桿粒上的fccZ基因的刪除,，這就可以通過在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選來鑒別含有重組桿粒的細(xì)菌,。這樣,，你就可以從具有白色菌落的大腸桿菌克隆中簡便地分離出含有編碼目標(biāo)基因的重組桿粒DNA去轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞。DNA轉(zhuǎn)化會啟始病毒的感染并導(dǎo)致子代重組桿狀病毒的產(chǎn)生,。這種體內(nèi)轉(zhuǎn)座法可以以100% 的效率產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA,。它的商業(yè)化產(chǎn)品最初稱為Bac-toBac系統(tǒng)，由LifeTechnologies 公司開發(fā),，而現(xiàn)在可以從Invitrogen公司購買,。Bac-toBac系統(tǒng)以細(xì)菌為中心的特點(diǎn)是很重要的，因為它可以讓不熟悉病毒學(xué)而更熟悉細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)的研究人員仍然在自己熟悉的領(lǐng)域工作,。但是,，該系統(tǒng)存在的一個不足是重組桿狀病毒保留了細(xì)菌的復(fù)制子，與不含有該結(jié)構(gòu)的病毒相比,，它使桿粒在昆蟲細(xì)胞中傳代時具有高度的遺傳不穩(wěn)定性[Pijlman等(2003) 及見下文],。

近期,Possee和King的研究小組提出了一種更為聰明的想法，該方法是線性化桿狀病毒DNA法和桿粒法的交叉雜合（P0sseeetal.,，2008),。從本質(zhì)上講，他們構(gòu)建了一個新型的具有重組桿狀病毒基因組的桿粒,，該基因組在多角體座位有一個細(xì)菌的復(fù)制子(replicon)且缺失了下游的烈基因（圖14.6),。由于存在細(xì)菌復(fù)制子及缺失了基因，這個桿?？梢栽诖竽c桿菌中復(fù)制, 但是不能在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制,。因此，可以使用攜帶有這種桿粒的大腸桿菌方便地制備用于構(gòu)建重組子代病毒載體的親代桿狀病毒基因組 DNA,。你可以簡單地從大腸桿菌中分離出病毒DNA,，與轉(zhuǎn)移質(zhì)?；旌虾蠊厕D(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。在病毒與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA之間的同源重組會同時恢復(fù)#/2629,，在多角體蛋白基因座敲除細(xì)菌復(fù)制子并且在相同位置插入目標(biāo)基因,。盡管這種方法沒有提高同源重組的效率，但是明顯提高了在共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生重組桿狀病毒的效率,，因為親代病毒DNA 是有缺陷的,，不能自我復(fù)制。該方法已經(jīng)由oxfordExpressionTechnologies進(jìn)行了商業(yè)化,，產(chǎn)品為flashBAC,。flashBAC系統(tǒng)有一個值得再次強(qiáng)調(diào)的特點(diǎn)，如上所示, 細(xì)菌的復(fù)制子在同源重組中被剔除,。這樣做的優(yōu)點(diǎn)在于消除了用常規(guī)桿粒(保留有細(xì)菌的復(fù)制子)制備桿狀病毒載體時的遺傳穩(wěn)定性問題(Pijlmanetal.,，2003)。另一個值得再次強(qiáng)調(diào)的特點(diǎn)是在flashBAC系統(tǒng)中使用的桿粒包含了在昆蟲細(xì)胞中不能復(fù)制的缺陷型桿狀病毒基因組,。顯然,，這就意味著在該系統(tǒng)中，需要親代缺陷型病毒基因組與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒之間的同源重組來形成不需要輔助的子代桿狀病毒,。但是，這并不一定意味著共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞將只能產(chǎn)生重組的子代桿狀病毒,。由于遺傳互補(bǔ)作用（geneticcomplementation),，這些細(xì)胞也能夠產(chǎn)生源于缺陷型親代病毒基因組的子代病毒。特別的是,，在共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的重組病毒能夠提供的產(chǎn)物,，它為缺陷型病毒DNA的順式裝配提供了輔助功能。使用flashBAC系統(tǒng)制備桿狀病毒時至少要進(jìn)行一輪空斑純化,，然而OxfordExpressionSystems的商業(yè)文獻(xiàn)指出這是不必要的,。不進(jìn)行空斑純化，通過共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得的原始重組病毒將會污染有缺陷型的親代病毒, 它們會干擾接下來的載體復(fù)制與外源基因的表達(dá),。

制備桿狀病毒載體最簡單的途徑可能是使用一種交叉雜合了Gateway技術(shù)與線性化親代病毒DNA技術(shù)的方法（Hartley,2003;WalhoutetaL,2000),。該方法涉及編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的Gateway進(jìn)入質(zhì)粒(entryplasmid)以及線狀的親代病毒DNA在體外而不是體內(nèi)的重組。在這個系統(tǒng)中, 親代病毒DNA以線狀的形式存在,，其基因組中的多角體蛋白編碼序列被大腸桿菌LacZ基因和單純痕瘆病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶(thymidinekinase)基因替換,，替換序列的兩側(cè)有噬菌體1的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)（attRl 和 attR2; 圖M.7)(site~specificrecombinationsite)。含有LacZ基因的病毒呈現(xiàn)出藍(lán)色空斑,，在添加有某種核苷類似物（nucleosideanalog),，如丙氧鳥苷（gancyclovir)的昆蟲細(xì)胞中培養(yǎng)，胸苷激酶基因提供了針對親代病毒DNA的陰性選擇標(biāo)記,。將線性化的病毒DNA與編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的 DNA進(jìn)人質(zhì)?；旌?，目標(biāo)蛋白質(zhì)編碼序列的側(cè)翼序列為A噬菌體的位點(diǎn)特異性重組序列（attLl和attL2)，在混合物中加人純的重組酶^沈,。!^!^-nase)(LRClonase;Invitrogen), 該酶會介導(dǎo)進(jìn)人質(zhì)粒和親代病毒上att位點(diǎn)間的位點(diǎn)特異性重組,。需要重點(diǎn)指出的是, 該體外反應(yīng)是一種非定量意義上的高效重組反應(yīng)，其產(chǎn)物為親代桿狀病毒DNA與重組桿狀病毒DNA的混合物,。隨后,，該混合物通過轉(zhuǎn)染進(jìn)人昆蟲細(xì)胞，像前面指出的那樣,，在含有丙氧鳥苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，丙氧鳥苷能夠阻止親代病毒的復(fù)制。經(jīng)過一輪篩選,，子代重組桿狀病毒載體的數(shù)目得到增加,，通過空斑形成實(shí)驗可以從相對較低水平的子代桿狀病毒背景中將其檢出,。在，半乳糖苷酶顯色底物存在的情況下,，重組體的空斑表型為白色,，可以依此很容易地將其鑒定出來。這種在體外獲得重組桿狀病毒載體的方法,，最初是由Franke與他的同事在LifeTechnologies研發(fā)出來的,。

然后由Harwood和他的同事在Invitrogen將其商品化為BaculoDirect系統(tǒng),。該系統(tǒng)使用起來非常地快速,、有效和簡單,。但是,，需要著重指出,，與flashBAC系統(tǒng)類似,BaculoDirect系統(tǒng)在市場上被宣傳為「無需空斑純化或細(xì)菌中的篩選,，即可從桿狀病毒克隆與表達(dá)基因」,，就像前面指出的那樣,，這不是好的建議，盡管胸苷激酶基因產(chǎn)物和丙氧鳥苷的存在會對親代病毒產(chǎn)生一個負(fù)向選擇壓力,，但用體外重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞仍然既會產(chǎn)生重組體子代又會產(chǎn)生親代病毒的子代,。因此,，研究人員在使用BaculoDirect系統(tǒng)時不要輕信廠商宣稱的內(nèi)容，相反應(yīng)進(jìn)行至少一輪的空斑純化將具有目標(biāo)基因的重組桿狀病毒從親代病毒污染中分離出來,。事實(shí)上, 那些接受了該建議并且使用了含有,，半乳糖苷酶的瓊脂層進(jìn)行空斑純化的研究人員通常至少會看到一些藍(lán)色的斑點(diǎn)，這顯示親代病毒的存在并肯定了對重組桿狀病毒的空斑純化是明智的決定,。公平地說,，商業(yè)化的BaculoDirect系統(tǒng)的操作手冊(Invitrogen)包括了在含有/■半乳糖苷酶的培養(yǎng)基上進(jìn)行空斑純化的方法，這提供了很大的便利,。

在了解了上述體外重組方法的基礎(chǔ)上,，還應(yīng)對一些已經(jīng)公開出版的直接體外重組DNA法進(jìn)行簡短的介紹。這些方法涉及對改進(jìn)后的桿狀病毒基因組進(jìn)行消化及其后與外源DNA片段的直接連接,。這些方法的一個實(shí)例涉及在AcMNPV基因組上多角體蛋白啟動子下游引入兩個&m36I位點(diǎn)（LuandMiller,1996),。這兩個位點(diǎn)的識別序列有著微小的差異,。經(jīng)&w36I位點(diǎn)消化后產(chǎn)生5’-TTA^的單鏈突出序列（singlestranded5’-TTA-3’overhangingsequence),，該序列可以在dTTP存在下被大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段轉(zhuǎn)化為 5~TT-3’的單鏈突出,。這就產(chǎn)生了一個線性的桿狀病毒DNA分子，任何DNA片段都可以與其進(jìn)行連接,，只要它經(jīng)過Ec0RI酶切后產(chǎn)生y-AATT-3’的單鏈突出,，然后再經(jīng)Klenow片段和dATP處理為V-AAW的單鏈突出,。這種改進(jìn)的主要目的在于給以桿狀病毒為基礎(chǔ)的cDNA表達(dá)庫的構(gòu)建提供方便,。其他兩個直接體外重組的實(shí)例都涉及在桿狀病毒基因組中引人歸巢內(nèi)切核酸酶（homingendonuclease)的酶切位點(diǎn)。其中一個是在AcMNFV基因組中引入一個I-Sce-I位點(diǎn)來構(gòu)建一個命名為Ac-Omega的重組體（Ernstetal.，1994),。分離自該病毒的基因組DNA可以被I-Sce-I消化后與被同樣的酶處理過的DNA片段連接,。另外一個被命名為Homingbac系統(tǒng)，它涉及在許多不同的桿狀病毒基因組中引入一個單一的I-Cew-I位點(diǎn)（Lihoradovaetal.,，2007),。從這些病毒中分離的基因組DNA被I-Cew-I線性化后可與用BsfXI處理后具有可匹配突出末端的DNA片段連接,。目前，本段描述的3種直接克隆的載體都沒有實(shí)現(xiàn)商品化,，在文獻(xiàn)報道中該方法也應(yīng)用得不多,。因此,，很難對這幾種直接克隆方法是否相對成功或者其桿狀病毒骨架能否廣泛用于制備桿狀病毒表達(dá)載體作出評估,。

除解決關(guān)于重組桿狀病毒載體構(gòu)建的早期技術(shù)難題外，一些對親代桿狀病毒基因組進(jìn)行改進(jìn)的目的是增強(qiáng)重組載體上外源蛋白的表達(dá),?；镜淖龇ㄊ莿h除這樣的一些桿狀病毒的基因:①已知這些基因?qū)Σ《驹谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中的復(fù)制是不需要，暫且定義為「附屬」(accesSory)基因;②認(rèn)為這些基因通過某些方式干擾了外源蛋白的產(chǎn)生或降解目標(biāo)蛋白質(zhì),。此類桿狀病毒DNA是最初由Bishop和同事們研發(fā)出的線狀病毒DNA,，后來被Novagen商品化為BacVector-2000。除多角體蛋白外,，這種病毒DNA還缺少其他5種未公開的附屬基因,。缺失這些基因?qū)τ谕庠吹鞍桩a(chǎn)量的影響一直都不清楚，因為沒有相關(guān)報道用這些基因缺失與否的桿狀病毒DNA進(jìn)行外源蛋白表達(dá)量的對比研究,。

接著, 另外兩個非必需基因: 一個編碼幾丁質(zhì)酶（Hawtinetd.,，1995), 另一個編碼組織蛋白酶樣蛋白酶(cathepsin-likeprotease)(Slacketal.，1995) 在BacVector-2000被剔除,，所形成的以AcMNPV為基礎(chǔ)的親代病毒DNA被稱為BacVector-3000(Nova-gen),。其他的以AcMNPV為基礎(chǔ)并缺失了病毒幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶樣蛋白酶基因的病毒包括一種被稱為BestBac(表達(dá)系統(tǒng))的商業(yè)化的桿粒和一種未商業(yè)化的稱為八出扣-DCC(Kabaetal.，2004)的經(jīng)修飾的桿粒,。flashBACtm系統(tǒng)中使用的桿粒同樣缺少有功能的幾丁質(zhì)基因,。親代病毒上幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶樣蛋白酶的缺失對重組桿狀病毒載體的子代病毒的外源基因表達(dá)的影響并不是完全清楚，但還是有一些資料可以參考,。

其中一項研究表明,，缺失這兩種酶的AcBacDCC表達(dá)的一個外源糖蛋白比含有這兩種酶的桿狀病毒載體表達(dá)的糖蛋白更不容易降解(Kabaetal.，2004),。這似乎與預(yù)期是一致的,，刪除病毒蛋白酶基因通常會促進(jìn)重組蛋白和分泌蛋白更好地表達(dá)。但是, 還需要做更多的工作來確定剔除某個特定的蛋白酶基因是否會廣泛的影響外源蛋白在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的生產(chǎn),。目前還比較少觀察到刪除病毒幾丁質(zhì)酶基因的潛在影響,。曾有研究顯示, 病毒幾丁質(zhì)酶駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它通過飽和宿主蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器來干擾分泌途徑蛋白的產(chǎn)生(Kabaetal.,2004),。如果上述機(jī)制是事實(shí), 那么刪除病毒幾丁質(zhì)酶基因從而達(dá)到?jīng)]有幾丁質(zhì)酶的目的, 這樣可能會增加分泌蛋白的表達(dá)水平,。但是，目前還沒有公開出版的研究證明單獨(dú)刪除以AcMNPV為基礎(chǔ)的載體, 如flashBAC上的幾丁質(zhì)酶基因所產(chǎn)生的影響,。研究顯示,，缺失了幾丁質(zhì)酶的AcBacDCC表達(dá)的外源蛋白降解減少, 但該病毒同時缺失了組織蛋白酶樣蛋白酶，這使得結(jié)果的解釋變得復(fù)雜化,。另外,，已有一篇出版的文獻(xiàn)顯示單獨(dú)或全部剔除重組絲蟲桿狀病毒(recombinantsilkwormbaculovirus)的幾丁質(zhì)酶或組織蛋白酶樣蛋白酶基因?qū)ν庠吹鞍咨a(chǎn)的影響[家蠶核型多角體病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,(BmNPV)，Leeetal.,，2006],。在這個系統(tǒng)中，編碼昆蟲纖維素酶(Cellulase)的重組BmNPV載體在刪除幾丁質(zhì)酶或組織蛋白酶樣蛋白酶基因時在蠶中表達(dá)的外源蛋白具有更高的水平和更好的酶活性,。而且,，用缺失這兩種病毒酶基因的載體可以獲得具有最高酶活性、最高表達(dá)量的纖維素酶,。你會推測這些結(jié)果顯示從AcMNPV為基礎(chǔ)的載體刪除病毒幾丁質(zhì)酶基因會有類似的效果,。但是，由于在這個研究中是以蠶（silkworm)而不是以昆蟲細(xì)胞系作為宿主, 這種推測的合理性會被削弱,。

DiamondBac是另一個通過刪除非必要基因在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中增強(qiáng)重組蛋白表達(dá)量的親代桿狀病毒DNA的例子,。如上所述，DiamondBac是與BakPAK6類似的商業(yè)化的,、預(yù)先線性化的桿狀病毒DNA,，但是這種病毒DNA還缺少有功能的WO基因，有研究顯示,，該基因與宿主細(xì)胞的裂解有關(guān)（WilliamsetaL,，1989)。因此,，制造商的商業(yè)文獻(xiàn)指出,，用該親代病毒產(chǎn)生的重組桿狀病毒載體感染的細(xì)胞會在感染過程中一直保持較高的細(xì)胞活性,，這會有助于提高重組蛋白的表達(dá)水平（Sigma-Aldrich,2008)。

DmmondBac的另一個讓人感興趣并有潛在用途的特點(diǎn)是,，在桿狀病毒基因組中的W0基因被蛋白二硫化物異構(gòu)酶（proteindisulfideisomerase,，PDI)基因替代，該基因編碼的一種伴侶蛋白能夠促進(jìn)二硫鍵的形成并有助于蛋白質(zhì)的折疊,。已有公開出版的證據(jù)表明,，在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中共表達(dá)PDI, 可以提高重組IgG的可溶性和分泌水平(Hsuetal.，1996),。Sigma-Aldrich的商業(yè)文獻(xiàn)指出,，WO基因的缺失以及PD7基因的插入可以將多數(shù)重組蛋白的總產(chǎn)量提高接近10 倍。但是,，沒有公開發(fā)表的研究對重組桿狀病毒載體有無WO基因缺失或PDI基因插入情況下外源蛋白的生產(chǎn)水平進(jìn)行比較,。

因此，在最終的分析中, 為了直接確定非必須病毒基因,，如病毒的幾丁質(zhì)酶基因,、組織蛋白酶樣蛋白酶基因和朽o基因的缺失對在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)的總體影響, 需要對合適匹配的AcMNPV來源的載體進(jìn)行直接比較研究。

除了DiamondBac親代桿狀病毒DNA外, 已有文獻(xiàn)報道有人設(shè)計出插入了編碼外源蛋白加工酶基因的桿狀病毒載體,，以此來提高外源蛋白的產(chǎn)量,。這之中就有一個重組桿狀病毒載體具有在P]0啟動子控制下的多分 DNA 病毒(polydnavirus)wai^yri77基因(Fath-Goodinetal.，2006),。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以延長被桿狀病毒轉(zhuǎn)染的 Sf9 細(xì)胞存活時間,，這相應(yīng)的就能夠提高在多角體蛋白啟動子控制下共表達(dá)的外源蛋白的產(chǎn)量。其他可以歸為此類的桿狀病毒載體包括具有在桿狀病毒id啟動子調(diào)控下的外源糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase)基因（Jarvisetal.,，2001;Tomiyaetal.,，2003)或與磷酸胞苷唾液酸（CMP-sialicacid)生物合成相關(guān)的酶的基因（Hilletal.，2006)的載體,。在載體中使用早期啟動子, 可以在感染的早期表達(dá)這些具有加工功能的蛋白質(zhì),，使其表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于外源蛋白的表達(dá),。這就使得昆蟲細(xì)胞的內(nèi)源性N-糖基化功能得到延伸，在目標(biāo)糖蛋白開始表達(dá)之前就具有了對蛋白質(zhì)進(jìn)行人源糖基化的能力。

一種轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢酝瑫r將多分 DNA 病毒基因和外源蛋白的基因引入到桿狀病毒基因組中,，Paratechs已將這種質(zhì)粒商品化。類似的,，在不久的將來,，具有更高級真核iV-糖基化功能的親代桿狀病毒DNA會被商業(yè)化并用于制備重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的出現(xiàn)會使對這些類型的病毒載體增加蛋白質(zhì)表達(dá)水平的能力或生產(chǎn)人源化糖蛋白的能力進(jìn)行全面評估變得更加方便,。目前, 未曾使用大量的外源蛋白/糖蛋白對這兩方面的能力進(jìn)行過評估,。

六、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的另一半

考慮到目前為止本章的重點(diǎn)都放在了桿狀病毒表達(dá)載體上,，很有必要提醒讀者，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)是一個由兩個部分組成的二元系統(tǒng),。當(dāng)然,，第一個部分就是桿狀病毒表達(dá)載體，它是一個昆蟲病毒,，其功能顯然就是將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的外源基因?qū)怂拗骷?xì)胞中,。桿狀病毒表達(dá)載體的另一個功能是為在晚期或極晚期啟動子控制下的目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄提供所需的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,。第二個部分就是到目前為止幾乎沒有提及的宿主,，通常是鱗翅類昆蟲細(xì)胞系,，但有時是鱗翅類的昆蟲。

鱗翅目昆蟲(OrderLepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶（butterfly)，它們是桿狀病毒家族中多種病毒(包括AcMNPV)的宿主,。Grace在1%2年第一個建立了鱗翅類昆蟲細(xì)胞系(Grace,1962)。至今,，已經(jīng)建立了超過250種昆蟲細(xì)胞系（Lynn,2007),。但是, 我們重點(diǎn)關(guān)注兩個桿狀病毒表達(dá)載體最常用的鱗翅類昆蟲細(xì)胞系。其中一個是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亞克隆IPLB-SF-21而建立的,，IPLB~SF-21細(xì)胞系是在1977年從草地貪夜蛾(Spodo卿ra/rwgipenia, 又稱為秋天行軍蟲）的卵巢組織中分離出來的 Sf9 細(xì)胞可以在很多商業(yè)公司購買到,，如Invitrogen和Novagen或者美國模式菌種收集中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC),。另外一種是HighFive, 最初是從粉紋夜蛾m’,，又稱為甘藍(lán)銀紋夜蛾(cabbageIooper)]的成熟卵巢組織中分離到的細(xì)胞系,，在1992年由Granados和Wood的小組稱為BTITn5B-1,，后被Invitrogen商業(yè)化為HighFive,。

Sf9和HighFive兩種細(xì)胞系的一個有趣的特點(diǎn)是二者都能夠以貼壁或懸浮狀態(tài)生長,。由于這個特點(diǎn)，通過感染數(shù)以百萬計的在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中生長的 Sft或 HighFive細(xì)胞,，可以很方便地進(jìn)行實(shí)驗室規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)實(shí)驗,。貼壁生長的 Sf21或Sf9 細(xì)胞也常規(guī)用于空斑篩選和重組桿狀病毒表達(dá)載體的定量,。另外，Sf9和HighFive兩種細(xì)胞都能夠在轉(zhuǎn)瓶（spinnerflask),、搖瓶（shakeflask),、氣升式攪拌槽（airlift,stirredtank)、Wave生物反應(yīng)器(Wavebioreactor) 中擴(kuò)大規(guī)模來生產(chǎn)大量的重組蛋白,。

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的條件和方法與大多數(shù)研究人員所熟悉的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法大不相同,。例如，培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的最適溫度是28°C而不是37°C另外,，Sft和HighFive

細(xì)胞貼壁不緊, 在傳代培養(yǎng)時不需要EDTA或胰酶(trypsin)處理。昆蟲細(xì)胞的生長不需要含有CO2的培養(yǎng)箱,，因為昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基是用磷酸鹽作為緩沖液而不是碳酸鹽,。Sf9和HighFive細(xì)胞都可以在有或沒有血清的培養(yǎng)基中生長, 這兩種培養(yǎng)基的來源都很廣。事實(shí)上, 從1990年本書的第一版面世以來, 多種不同的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基都能夠從多個不同的制造商那里買到,，其中最主要的包括ExpressionSystems,、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich,。但是,，需要指出的重要一點(diǎn)是，Sf9和HighFive細(xì)胞會傾向于逐漸適應(yīng)某種特定的培養(yǎng)基,。因此, 突然地將Sft和HighFive細(xì)胞的培養(yǎng)基由有血清培養(yǎng)基變換為無血清培養(yǎng)基會導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的損失,。一個更容易成功的做法是緩慢戒除血清法。例如,，在連續(xù)的4次傳代中,，你可以將無血清培養(yǎng)基的比例從0% 依次升高至25%,、50%、75%,，直至100%,。即使使用這種相對緩慢的血清戒除法，當(dāng)將細(xì)胞剛剛置于不含血清的培養(yǎng)基時,，這些細(xì)胞也會經(jīng)歷短暫的生長停止或生長緩慢,。因此, 保持耐心非常重要，因為這些細(xì)胞會在新培養(yǎng)基中遲滯生長12天后恢復(fù)正常的生長速率,。

緩慢血清戒除法不僅對從有血清培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)換有用,，還可以用于將昆蟲細(xì)胞從一種無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到另一種無血清培養(yǎng)基。

七,、桿狀病毒表達(dá)載體的新一代昆蟲細(xì)胞宿主

最早的鱗翅類昆蟲細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)出現(xiàn)在1990年（Jarvisetal.,，1990)。那時,，研發(fā)該技術(shù)的初衷在于構(gòu)建一個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞系,，它旨在能夠持續(xù)生產(chǎn)目標(biāo)重組蛋白而無需使用桿狀病毒進(jìn)行感染。然而, 構(gòu)建這個生產(chǎn)用細(xì)胞系所用的載體及方法也為構(gòu)建具有新型特色的轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞系提供了條件,，這些新型細(xì)胞系將能夠更好地支持重組桿狀病毒介導(dǎo)的外源蛋白的生產(chǎn),。第一個進(jìn)行宿主細(xì)胞改造的案例是要解決本章前面提出的一個問題, 即桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)能夠進(jìn)行真核蛋白加工，但這種加工與更高等真核細(xì)胞對蛋白質(zhì)的加工并不總是相同,。對于這個局限，大家了解最多的一個例子是Sft和HighFHve細(xì)胞都能夠?qū)π潞铣傻鞍踪|(zhì)進(jìn)行N-糖基化, 但其對JV連接的糖鏈(〗V-聚糖)[參考Harrison和Jarvis(2006;2007b),Shi和Jarvis(2007)的綜述]的加工卻達(dá)不到哺乳動物細(xì)胞那樣的程度,。第一個從改造細(xì)胞的角度來解決這個問題的方法是使用在AcMNPVid啟動子調(diào)控下的牛/M,，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（bovine片1，4-galactosyltransferase)cDNA轉(zhuǎn)化Sf9 細(xì)胞（Hollisteretal.,，1998),。該cDNA編碼Sf9 細(xì)胞中沒有的N-聚糖加工酶，導(dǎo)人該酶的目的是使Sf9 細(xì)胞的內(nèi)源蛋白加工能力得到擴(kuò)充,，這樣轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系生產(chǎn)的iV■糖基化糖蛋白的JV-聚糖就可以經(jīng)過進(jìn)一步的加工,，更接近于人源iV-聚糖。確實(shí),，最終得到的命名為S_GalT的細(xì)胞系具有該酶的編碼序列,，并能夠組成型表達(dá)這個哺乳動物基因，這使它具有了親代細(xì)胞系不具備的能力: 生產(chǎn)具有部分人源 N-聚糖結(jié)構(gòu)的外源糖蛋白,。但這僅僅是對細(xì)胞進(jìn)行改造的第一步,，因為需要對Sf9 細(xì)胞蛋白質(zhì)N-糖基化途徑進(jìn)行進(jìn)一步的人源化，而這需要「敲人」更多的其他哺乳動物功能基因,?？偟膩碚f, 可以通過構(gòu)建W啟動子驅(qū)動下的編碼其他功能的哺乳動物基因,，然后用其生成另外的轉(zhuǎn)基因 Sf9 細(xì)胞亞克隆來完成這個任務(wù)（Aumilleretal.，2003;HollisterandJarvis,，2001;Hollisteretal.,2002;Seoetal.,2001),。所構(gòu)建的每個細(xì)胞系都能夠支持桿狀病毒的復(fù)制和桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因表達(dá)，同時也能夠組成型地表達(dá)所轉(zhuǎn)入的哺乳動物基因,。最終,，每一個這種轉(zhuǎn)基因的昆蟲細(xì)胞系較其親代Sf9 細(xì)胞具有更深入的N-聚糖加工能力，能夠產(chǎn)生具有更接近人源JV-聚糖糖基的糖蛋白,。HighFive細(xì)胞也有類似的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,，它們轉(zhuǎn)入了在id啟動子控制下的兩種不同的哺乳動物糖苷轉(zhuǎn)移酶的基因（BreitbachandJarvis,2001)。Invkrogen已經(jīng)將一個最初命名為SfSWT-I的源于 Sf9細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞系商業(yè)化,，其商業(yè)名為MIMIC, 該細(xì)胞系具有更深入的N-糖基化途徑,，在含有血清的培養(yǎng)基中生長時能夠表達(dá)出人源化的重組糖蛋白。在不久的將來,，具有很多哺乳動物基因的更髙級的昆蟲細(xì)胞系會被商業(yè)化,，這樣的細(xì)胞系能夠在不含血清的培養(yǎng)基中生產(chǎn)具有唾液酸化末端糖基的糖蛋白（Aumilleretal.>2003)。另有一種很有希望作為改進(jìn)的桿狀病毒表達(dá)載體宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因鱗翅類昆蟲細(xì)胞系衍生于 Sf9細(xì)胞,，它轉(zhuǎn)人了立即早期桿狀病毒啟動子控制下的多分DNA病毒 Wznbrin 基因(Fath-Goodinetal.,2006),。就像上面討論的那樣，桿狀病毒介導(dǎo)的多分DNA病毒 mMyhn 基因的表達(dá)可以使桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞活的更長,，從而增加了在多角體蛋白啟動子控制下的共表達(dá)的外源蛋白的產(chǎn)量,。同樣的道理，一個經(jīng)過工程改造能夠組成型表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因Sft 細(xì)胞系具有更長的壽命,，感染攜帶黃色熒光蛋白基因的重組桿狀病毒后能夠以更高水平表達(dá)黃色熒光蛋白（Fath-Goodinetal.,2006),。ParaTechs公司已經(jīng)將 3種不同的衍生于 vankyrin-enhanced(VE)Sf9的細(xì)胞系進(jìn)行了商品化。

目前已經(jīng)有了 MIMIC 和 VE 細(xì)胞系, 將來會出現(xiàn)別的同樣類型的轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞系,，它們的出現(xiàn)能夠允許研究人員對這些細(xì)胞系生產(chǎn)人源化糖蛋白的能力和提高重組蛋白表達(dá)水平的能力進(jìn)行更加全面的分析,。這樣的分析很重要，因為這兩種類型的經(jīng)過改進(jìn)的桿狀病毒表達(dá)載體的宿主都沒有使用大量的不同外源蛋白 Z 糖蛋白對其進(jìn)行廣泛的評估,。事實(shí)上,，已有關(guān)于 MIMIC(SfSWT-I) 細(xì)胞不能夠?qū)⒁环N特別的外源糖蛋白，馬的黃體生長激素/域毛膜促性腺激素（equinelutenizinghormone/chorionicgondotropin)(LegardinieretaL,，2005) 唾液酸化的報道,。這兩種馬的糖肽類激素是由相同的基因編碼的，因而有相同的氨基酸序列,。根據(jù)對天然產(chǎn)物（Smithetal.,，1993)N-連接糖蛋白特征的分析，你會預(yù)期 MIMIC(SfSWT-l) 細(xì)胞產(chǎn)生的重組激素在末端有 a2,3-連接的唾液酸殘基,。因此,，:Legardmier 與他的同事獲得的結(jié)果很可能反映了 MIMIC(SfSWT-1) 細(xì)胞不能對馬的促黃體生長激素/絨毛膜促性腺激素進(jìn)行 a2,，3-連接形式的唾液酸化，之前從未對該細(xì)胞的這種能力做過評價,。事實(shí)上,，最近我們發(fā)現(xiàn), 盡管 MIMIC(SfSWT-1) 細(xì)胞編碼并表達(dá)鼠的 a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶 U2，3-sialyltransferase), 但卻未檢測出細(xì)胞中有該酶的活性 (數(shù)據(jù)未給出）?，F(xiàn)在清楚了 MIMIC(SfSWT-l) 細(xì)胞不具有對所有目標(biāo)外源N-糖基化蛋白進(jìn)行唾液酸化的能力,。研究人員正在嘗試構(gòu)建新的細(xì)胞系，它可以進(jìn)行 a2,6-和a2,3-唾液酸化,。但是,，一種具有 a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的新轉(zhuǎn)基因昆蟲細(xì)胞系也有可能不能唾液酸化所有的目標(biāo)糖蛋白。而且,，如果在 VE 細(xì)胞和其他的作為桿狀病毒表達(dá)載體改進(jìn)的宿主的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中都出現(xiàn)這種局限, 不要感到驚訝,。

八、桿狀病毒的基本操作方案

本書第一版的第 10 章中就已經(jīng)包含了許多重要的關(guān)于桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建,、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng),、桿狀病毒表達(dá)載體的生產(chǎn)、分離和鑒定的較為詳細(xì)的操作方案,，還有在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)體系中表達(dá)重組蛋白所需的分析方法 (Bradley,1990), 這些至今仍然可以使用,。此外，也相繼出版了大量有關(guān)桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)體系的書籍,，這些書籍或其章節(jié)都有詳細(xì)的技術(shù)方案（KingandPossee,1992;Murhammer,，2007;O’reillyetal.，1992;Richardson,，1995;SummersandSmith,，1987)。最后指出,，對于本章中提到的那些為便于制備和分離重組桿狀病毒表達(dá)載體而構(gòu)建的新型桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和桿狀病毒基因組骨架，每個構(gòu)建者都提供了詳細(xì)的圖譜,、序列和使用所需的分步操作方案,，這些都可以從他們的網(wǎng)站免費(fèi)得到。相應(yīng)地,，我也選擇了一些在我們實(shí)驗室使用的, 相對小型的,，但都是必須的一套經(jīng)過數(shù)次檢驗的技術(shù)方案和大家分享, 這些技術(shù)方案來源于 Summers和Smith(1987)及 O7ReiUy 等(19)編寫的桿狀病毒使用者「手冊」，但在某些部分,，根據(jù)我們的需要進(jìn)行了適當(dāng)?shù)馗牧?。對于本章提到的任何具體方法，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和親代桿狀病毒載體,，讀者可以參考下面給出的來源去獲取有關(guān)的直接詳細(xì)信息, 此處就不再進(jìn)行復(fù)述了,。

昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)

我們通常在125 mL 的DeLong 搖瓶（Bellco) 中培養(yǎng) 50 mL 的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物,，不論使用有血清或無血清培養(yǎng)基。對于有血清培養(yǎng), 我們使用添加了 10%(V/V) 胎牛血清 (HyClone)和 01% 聚醚 F68(pluronicF68)(Sigma-Aldrich)的 TNM-FH 培養(yǎng)基,；對于無血清培養(yǎng),，我們使用 ESF921(表達(dá)系統(tǒng)）。在我們的細(xì)胞培養(yǎng)中,，我們既不將胎牛血清進(jìn)行熱滅活,，也不在培養(yǎng)基中添加抗生素，因為使用我們的標(biāo)準(zhǔn)共挑選方法(standardcoselectionapproach) 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因亞克隆的構(gòu)建時,，它們會產(chǎn)生干擾（HarrisonandJarvis,，2007a;JarvisandGuarino,1995)。在每周的周一,、周三和周五, 我們將培養(yǎng)的細(xì)胞傳代,，在周一和周三，Sf9細(xì)胞的接種密度為 0.5X106 個細(xì)胞/mL, 在周五為 0.3X106 個細(xì)胞/mL,。使用標(biāo)準(zhǔn)的臺盼藍(lán)染色排除法在血細(xì)胞計數(shù)器上檢測細(xì)胞密度（Murhammer,2007),。在搖瓶培養(yǎng)中 Sf9細(xì)胞的活力應(yīng)維持在較高的水平，其倍增時間應(yīng)在 24 h 左右,。

對于更大量的細(xì)胞, 其培養(yǎng)可進(jìn)行如下放大:100 mL 的細(xì)胞在 250 mL 的DeLong 搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng),，200 mL 的細(xì)胞在 500 mL 的DeLong 搖瓶中，或者 800 mL 的細(xì)胞在 2.8L 的 Fembach 瓶子(Bellc0) 中培養(yǎng),。轉(zhuǎn)基因的昆蟲細(xì)胞系的接種密度各有不同,，通常均高于Sf9細(xì)胞的接種密度。在我們最近的實(shí)踐中,，以與 Sf9細(xì)胞相同的接種密度接種轉(zhuǎn)基因的昆蟲細(xì)胞系,，它們的生長會變慢并且/或者經(jīng)歷一個暫時的停滯，之后再開始以正常速率生長,。

桿狀病毒基因組DNA的分離

除非你可以一直購買商業(yè)來源的已經(jīng)純化過的病毒DNA,，因為分離出足夠純度的桿狀病毒基因組DNA是制備重組桿狀病毒表達(dá)載體的一個重要方面。采用差速離心方法,，我們可以從芽生病毒(buddedvirus)中分離出病毒DNA,。使用合適的親代病毒感染 S9細(xì)胞，為避免缺失性干擾粒子（defectiveinterferingparticle)的產(chǎn)生（Kooletal.,，i9,；n)，應(yīng)使用較低的感染復(fù)數(shù) (如 o.Oi 空斑形成單位/細(xì)胞）,。如上所述,，采用加有胎牛血清和普朗尼克(pluronic)F68 的 TNM-FH 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 3~5 天，并在相差顯微鏡下監(jiān)控細(xì)胞的病理學(xué)征兆,。一旦觀察到明顯的感染跡象,，立即將感染的細(xì)胞在無菌的條件下轉(zhuǎn)移到一次性使用的離心管中,，大約 1000ul 離心 15 min。將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管（如 33 mL 的BeckmanSW28 離心管）中,，之后將含有 5 mmol/LNaCl和 10 mmoI/LEDTA的 25%(m/V) 蔗糖溶液小心地加入離心管底部 (如 3 mL 的BeckmanSW28 離心管）,。再將離心管以 4°C, 大約 100000 g 離心 75 min(如對于 BeckmanSW28 轉(zhuǎn)子，可采用 28000r/min),，之后,，將上清液傾出，留下芽生病毒的沉淀塊,。使用藍(lán)色槍頭 (剪掉尖端,，以具有較大的口徑) 加入一定量的裂解緩沖液 (每毫升的初始感染性病毒培養(yǎng)基中加入 0~ImL) 溫和重懸病毒沉淀，裂解緩沖液的組成為 10 mmol/L Tris(pH7.6),、10 mmol/L EDTA 和 0.25%(m.V)SDS,。然后向其中加人蛋白酶 K(10 mg/mL, 溶于水）至終濃度為500jug/mL, 將其置于 37°C 孵育，間或旋轉(zhuǎn),，直至溶液變得澄清, 這個過程通常需要 4 h 到一整夜,。如果溶液仍是比較渾濁的, 那么應(yīng)加入更多的裂解緩沖液和蛋白酶 K。將所得溶液依次釆用苯酚和苯酸-氯仿進(jìn)行溫和的抽提,，之后,，在0.3mol/L 乙酸鈉存在下通過乙醇沉淀病毒DNA。最后, 使用 TE 重懸 DNA 沉淀 (相對每毫升的初始培養(yǎng)物加入 10fxL 的 Tris-EDTA 緩沖液進(jìn)行重懸),。重懸的病毒DNA 濃度可采用分光光度計進(jìn)行估測,，但是，我們發(fā)現(xiàn)其非常不可靠,。所以,，我們一般通過對比法來使該估值更精確: 使用 Ec0RI 或Hhdin 消化 10 的病毒DNA，然后將消化產(chǎn)物與已知濃度的商業(yè)化 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，接著以溴化乙錠或其他 DNa 染色方法染色,。應(yīng)該注意的是，這種方案與 o,，Reilly 與其同事（O’reillyetal.,，1992)在桿狀病毒表達(dá)載體使用手冊中所描述的方案在本質(zhì)上是一樣。

桿狀病毒的空斑分析

總的來說,，空斑分析是病毒學(xué)的一個重要方面,。它是確保重組病毒以單一克隆形式被分離出來的最佳方法,。進(jìn)行空斑分析的準(zhǔn)備工作包括兩個互相獨(dú)立的步驟:①在培養(yǎng)皿中預(yù)接種指示細(xì)胞;②將病毒儲存液進(jìn)行一系列的 10 倍梯度稀釋,。如上所述, 我們使用在搖瓶中培養(yǎng)的處于對數(shù)期生長期的S9細(xì)胞進(jìn)行接種, 該細(xì)胞的生長培養(yǎng)基為含有 10% 胎牛血清和 0.1% 普朗尼克 F68 的 TNM-FH。將所需數(shù)目的細(xì)胞溫和離心后丟棄舊的培養(yǎng)基,，然后使用新鮮的無添加物的 TNM-FH 重懸細(xì)胞, 最后將細(xì)胞以 0.75XIO6個細(xì)胞/孔的密度接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (corning),。在 28°C 下 I 障育 Ih 以使細(xì)胞沉降并貼附于培養(yǎng)板的塑料內(nèi)壁,。相對于培養(yǎng)基中有血清時，培養(yǎng)基中無血清時細(xì)胞會更加緊密地附著于培養(yǎng)板,。在細(xì)胞進(jìn)行貼壁時,，可以將病毒儲備液進(jìn)行一系列的 10 倍梯度稀釋，該稀釋建立在一個假設(shè)之上,，即病毒儲備液具有的噬斑實(shí)驗滴度為IXlO7pfu/mL,。

我們采用含有胎牛血清和普朗尼克 F68 的 TNM-FH 作為稀釋液，0.ImL 的病毒液加人 9.9 mL 的稀釋液后為 100 倍的稀釋,0.5 mL 的病毒液加入 4.5 mL 的稀釋液后為 10倍的稀釋,。設(shè)置好空白稀釋液后在無菌的條件下進(jìn)行稀釋,，每次轉(zhuǎn)移溶液后采用渦旋混合器混勻。在完成稀釋和細(xì)胞已經(jīng)貼附于培養(yǎng)板后進(jìn)行細(xì)胞接種,，每個稀釋度接種兩個細(xì)胞孔,。將細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基移除后每孔加入 2 mL 的病毒稀釋液。這是該實(shí)驗中的關(guān)鍵步驟,，因為細(xì)胞會很快干掉,，如操作太慢, 培養(yǎng)皿邊緣的細(xì)胞將會死亡。所以,，每次最好只移除兩個孔的培養(yǎng)基,，并立即加人相同濃度的病毒稀釋液，然后,，再進(jìn)行下一對細(xì)胞孔和下一個稀釋濃度的操作,。我們一般采用 10_5、10—6 和 10_7 的病毒稀釋度進(jìn)行感染,，以便于得到合理數(shù)目的空斑用于計數(shù),。再將病毒與細(xì)胞置于 28°C 孵育 Ih 以使病毒吸附于細(xì)胞，這期間應(yīng)同時制備覆蓋培養(yǎng)基 (overlaymedium),。我們準(zhǔn)備了一個 125 mL 的瓶子,，瓶子裝有 50 mL2%(m/V)的溶于水的Seaplaque 低熔點(diǎn)瓊脂糖 (Cambrex), 將該瓶進(jìn)行高壓滅菌, 隨后使瓊脂糖凝固。所得的瓶裝固態(tài)瓊脂糖可以采用微波處理使其再次融化, 之后冷卻到大約 60°C 與等體積的已經(jīng)預(yù)熱到 30°C 的 2XGrace,、培養(yǎng)基 (每孔需要 3 mL) 混合,。如果使用藍(lán)、白斑篩選來幫助鑒定假定的重組病毒,，那么,，此時應(yīng)將顯色底物加入覆蓋培養(yǎng)基中。接著將覆蓋培養(yǎng)基進(jìn)行渦旋混合以獲得均勻的混合物,，再冷卻至 40~42°C,。最后，將感染的細(xì)胞從孵育箱取出，使用移液管徹底吸出病毒接種物,，并將 3 mL 的覆蓋培養(yǎng)基從孔的邊緣緩慢地加人到培養(yǎng)孔,。同樣的，每次先吸出 2 個孔的病毒接種物,，再相應(yīng)加人覆蓋培養(yǎng)基,，之后進(jìn)行下一組的操作，避免細(xì)胞脫水和死亡,。放置 15 min 以使覆蓋培養(yǎng)基變硬, 將培養(yǎng)皿置于封閉的塑料袋中,，顛倒后于 28°C 孵育 7~10 天。使用解剖顯微鏡觀察空斑并仔細(xì)計數(shù), 使用所得的空斑數(shù),、稀釋倍數(shù)及感染體積來計算原始病毒儲存液的滴度,。