原名：Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN  

譯名：環(huán)狀RNA circSLC8A1海綿miR-130b/miR-494通過調(diào)節(jié)PTEN抑制膀胱癌進展

期刊：Molecular Cancer

IF：10.67（2018影響因子）

發(fā)表時間：2019年

通訊作者：郭宏騫

通訊作者單位：南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

DOI號：10.1186/s12943-019-1040-0

從RNA測序數(shù)據(jù)中鑒定出差異表達的circRNA，并將circSLC8A1確定為一個新的候選circRNA,。qRT-PCR法檢測circRNAs,、miRNAs和mRNAs在人體組織和細胞中的表達。采用RNA下拉實驗和熒光素酶報告實驗研究特異性circRNA,、miRNA與mRNA之間的相互作用,。體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，觀察circSLC8A1對膀胱癌細胞的作用,。Western blot檢測PTEN的表達,。通過劃痕實驗、Transwell實驗和CCK-8實驗檢測其生物學(xué)作用,。

1. CircSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中的表達顯著下調(diào)

CircSLC8A1起源于SLC8A1基因,，由外顯子1(1832bp)的頭尾拼接組成 (圖 1a)。為探討circSLC8A1在膀胱癌組織中的表達情況，研究人員檢測了70對膀胱癌組織和正常膀胱組織中circSLC8A1的表達水平,，結(jié)果證實circSLC8A1在膀胱癌組織中明顯低表達 (圖 1b),。值得注意的是，對膀胱癌腫瘤樣本的配對分析顯示,，在所有患者樣本中,，circSLC8A1的表達減少的標(biāo)本數(shù)超過80% (圖 1c)。相關(guān)分析顯示,，circSLC8A1的表達與臨床病理特征(包括病理分期和組織學(xué)分級)相關(guān)(表 1),。此外，circSLC8A1在6個膀胱癌細胞系(5637,、T24,、J82、EJ,、UMUC和RT4)中的表達低于正常尿路上皮細胞系SV-HUC-1 (圖 1d),。接下來，研究設(shè)計了聚斂引物來擴增SLC8A1 mRNA,，發(fā)散性引物來擴增circSLC8A1,。以5637和T24細胞的cDNA和gDNA(基因組DNA)為模板，circSLC8A1在cDNA中只被發(fā)散性引物擴增,，而在gDNA中沒有觀察到擴增產(chǎn)物(圖 1e),。通過qRT-PCR進一步證實circSLC8A1對RNase R具有抗性，而RNase R處理后的SLC8A1 mRNA顯著減少(圖 1f),。

圖 1 CircSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調(diào),。a SLC8A1外顯子1形成環(huán)狀SLC8A1的示意圖。RT-PCR證實了circSLC8A1的存在,，Sanger測序證實了circSLC8A1的后剪接,。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊拼接位點。b和c采用不同引物的qRT-PCR檢測證實,，70對人膀胱癌組織中circSLC8A1的表達水平均低于癌旁正常組織,。d 用qRT-PCR檢測circSLC8A1在SV-Huc-1和膀胱癌細胞系中的表達。e RT-PCR證實在5637和T24細胞系中存在circSLC8A1,。發(fā)散性引物可在cDNA中擴增circSLC8A1,，但在基因組DNA(gDNA)則不能,。f 采用qRT-PCR方法檢測RNase R處理前后5637和T24細胞中CircSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達,。

2. 過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲

鑒于本研究中circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中表達下調(diào)，研究人員將circSLC8A1表達載體轉(zhuǎn)染5637和T24細胞,，并顯著上調(diào)了circSLC8A1的表達(圖 2a),。同時，SLC8A1 mRNA的表達無明顯變化(圖 2a)。細胞劃痕實驗顯示,，circSLC8A1的過表達顯著抑制了5637和T24細胞的遷移(圖 2b),。細胞侵襲和遷移實驗一致表明，circSLC8A1的過表達也抑制了膀胱癌細胞系的遷移和侵襲能力,。(圖 2c和2d),。將針對circSLC8A1連接位點的siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細胞。這些siRNA顯著降低了circSLC8A1的表達,，但對SLC8A1 mRNA沒有影響(圖 2e),。細胞劃痕實驗和Transwell分析表明，敲除circSLC8A1顯著增加了5637和T24細胞的遷移和侵襲能力 (圖2f-h),。

圖 2 CircSLC8A1過表達抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲,。a qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ蛰d體質(zhì)粒后5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達水平。b 通過劃痕實驗觀察circSLC8A1對5637和T24細胞遷移能力的影響,。c and d  通過遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染circSLC8A1和對照載體的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力,。e將兩個針對circSLC8A1的siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細胞。采用qRT-PCR檢測各siRNA對circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效果,。f 通過劃痕實驗,，分別觀察了circSLC8A1-1對5637和T24細胞遷移能力的影響，并用流式細胞儀檢測了sIcSLC8A1-1對細胞遷移能力的影響,。g and h 用遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染si circSLC8A1-1或siNC的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力,。

3. circSLC8A1在膀胱癌細胞中作為miR-130b和miR-494的海綿

生物素標(biāo)記的探針在5637、T24和SV-HUC-1細胞系中被證實能下拉circSLC8A1(圖 3a和b),。檢測了7個候選miRNAs的水平,，結(jié)果表明在5637和T24細胞中miR-130b和miR-494是僅有的兩個miRNAs能被circSLC8A1充分下拉(圖 3c、d和e),。生物素標(biāo)記的miR-130b/miR-494比生物素標(biāo)記的陰性對照捕獲了更多的circSLC8A1(圖 3f和g),。此外，RNA FISH實驗表明,，circSLC8A1和miR-130b/miR-494共定位于細胞質(zhì)中(圖3h和i),。

圖 3 CircSLC8A1在膀胱癌細胞中作為miR-130b和miR-494的海綿。a and b 將5637,、T24和SV-HUC-1裂解產(chǎn)物中的circSLC8A1拉下,，用circSLC8A1特異性探針富集，然后用qRT-PCR進行檢測,。C, d and e 用qRT-PCR檢測5637,、T24和SV-HUC-1裂解產(chǎn)物中7個候選miRNA的相對水平。在5637和T24細胞系中,，circSLC8A1探針可以拖拽多個miRNA,，并且miR-130b和miR-494都可以被circSLC8A1探針拖拽,。f and g 將生物素標(biāo)記的miR-130b或miR-494轉(zhuǎn)染5637和T24細胞。鏈霉親和素捕獲后,，用qRT-PCR定量檢測circSLC8A1的水平,。h and i RNA FISH實驗檢測T24中circSLC8A1和miR-130b/miR-494的共定位情況。細胞核染成藍色(DAPI),，circSLC8A1染成紅色,，miR-130b/miR-494染成綠色。

4. miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展

qRT-PCR結(jié)果顯示,，與正常膀胱組織相比,，膀胱癌組織中miR-130b和miR-494表達上調(diào)(圖 4a和b，表2),。相關(guān)分析顯示,，circSLC8A1的表達與miR-130b或miR-494呈負相關(guān)(圖 4c和d)。過表達miR-130b和miR-494顯著促進了5737和T24細胞的增殖(圖 4e和f),。Transwell分析表明,，miR-130b或miR-494的過表達顯著促進了5637和T24細胞的遷移和侵襲(圖 4g和h)。相反,，轉(zhuǎn)染miR-130b/miR-494抑制劑明顯抑制5637和T24細胞的遷移和侵襲(圖 4i和j),。根據(jù)TargetScan (http://www./) 和Miranda預(yù)測，研究者發(fā)現(xiàn)miR-130b和miR-494都能與PTEN的3’-UTR區(qū)域結(jié)合(圖 4k),。接下來,，進行熒光素酶報告分析來驗證這種相互作用。結(jié)果表明,，與模擬物NC相比,，轉(zhuǎn)染miR-130b或miR-494模擬物可顯著降低攜帶野生型PTEN 3’-UTR的熒光素酶報告基因的活性。相反,，突變的熒光素酶報告不受miR-130b或miR-494過表達的影響(圖 4l),。Western blot分析表明，miR-130b或miR-494模擬物可以抑制PTEN的表達(圖 4m),。

圖 4 miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展,。a and b qRT-PCR結(jié)果顯示，30例膀胱癌組織中miR-130b和miR494的表達均高于癌旁正常組織,。c and d 皮爾遜相關(guān)分析提示circSLC8A1的表達與miR-130b/miR-494呈負相關(guān)。e and f CCK-8實驗顯示miR-130b和miR-494對5637和T24細胞的增殖有促進作用,。g and h 遷移和侵襲實驗表明,，轉(zhuǎn)染miR-130b或miR-494模擬物的5637和T24細胞的遷移和侵襲能力增強。i and j 轉(zhuǎn)染抗miR-130b或抗miR-494可抑制5637和T24細胞的遷移和侵襲,。k 生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-130b/miR-494結(jié)合位點在PTEN mRNA 3’-UTR中,。l 熒光素酶報告實驗證實miR-130b/miR-494與PTEN mRNA的相互作用,。m miR-130b和miR-494分別降低PTEN蛋白表達水平,。

5. CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN表達并抑制膀胱癌進展

CircSLC8A1的過表達導(dǎo)致膀胱癌細胞的侵襲和增殖能力受到抑制,，但這種作用可以被miR-130b或miR494的異位表達部分減弱(圖 5a，b和c),。此外,，我們還發(fā)現(xiàn)，與單獨轉(zhuǎn)染circSLC8A1質(zhì)粒的細胞相比(圖 5d和e),，共同轉(zhuǎn)染circSLC8A1質(zhì)粒和miR-130b/miR-494模擬物的膀胱癌細胞中PTEN的表達明顯降低,，這與細胞功能的結(jié)果一致。此外,，膀胱癌組織中PTEN蛋白的表達水平明顯低于癌旁組織(圖 5f),。上述結(jié)果表明，circSLC8A1通過海綿miR-130b/miR-494和調(diào)節(jié)PTEN的表達來抑制膀胱癌的進展,。

圖 5 CircSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN的表達,，抑制膀胱癌的進展。a, b and c Transwell侵襲和CCK-8檢測顯示,，CircSLC8A1抑制5637和T24細胞的侵襲和增殖,，當(dāng)與miR-130b或miR-494共轉(zhuǎn)染時，抑制作用被逆轉(zhuǎn),。d and e Western blot結(jié)果顯示,，miR-130b和miR-494可部分降低circSLC8A1促進的PTEN蛋白表達水平。f 10對人膀胱癌組織及癌旁正常組織中PTEN蛋白的Western blot分析,。

6. CircSLC8A1體內(nèi)抑制膀胱癌腫瘤生長的實驗研究

裸鼠皮下注射癌細胞后每周測量腫瘤體積,。與對照組相比，circSLC8A1過表達組的生長速度和腫瘤重量顯著降低(圖 6c和d),。在circSLC8A1過表達組中,，circSLC8A1表達水平上調(diào)，然而根據(jù)qRT-PCR結(jié)果,，miR-130b和miR-494水平下調(diào)(圖 6e),。IHC分析表明，通過過度表達circSLC8A1(圖 6f),，PTEN在腫瘤中的表達增加,。這些結(jié)果表明，circSLC8A1過表達能有效地抑制膀胱癌的體內(nèi)生長,。

圖 6 CircSLC8A1在體內(nèi)對膀胱癌腫瘤的生長有抑制作用,。a 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ蛰d體的T24細胞皮下注射至裸鼠皮下，建立皮下移植瘤(n=6),。b 裸鼠異種移植瘤形成示意圖,。c and d 與空白載體組相比,，circSLC8A1處理組裸鼠的腫瘤生長率和重量均顯著降低。e采用qRT-PCR方法檢測腫瘤組織中circSLC8A1,、miR-130b和miR-494的表達水平,。f 免疫組化染色檢測移植瘤中PTEN、AKT,、p-AKT和MMP9的表達,。

綜上所述，研究結(jié)果表明,，circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中表達下調(diào),，并且它能夠作為miR-130b和miR-494的海綿來調(diào)節(jié)PTEN的表達。此外,，還證明了通過靶向miR-130b,、miR-494/PTEN軸，circSLC8A1的過表達可以有效地抑制膀胱癌的進展,。研究結(jié)果不僅解釋了circRNA調(diào)控膀胱癌細胞生長的機制,，而且為膀胱癌的治療提供了一個潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點。