大家好，今天和大家分享的是2020年2月發(fā)表在Aging（IF=4.831)上的一篇文章：Cancer stem cell-specific expression profiles reveal emerging bladder cancer biomarkers and identify circRNA_103809 as an important regulator in bladder cancer,，“癌癥干細(xì)胞特異性表達(dá)譜揭示了新興的膀胱癌生物標(biāo)志物,，并確定circRNA_103809為膀胱癌的重要調(diào)節(jié)物”,。在這篇文章中，作者基于來(lái)自三個(gè)膀胱癌標(biāo)本的兩個(gè)微陣列的RNA表達(dá)數(shù)據(jù),，分析了與膀胱癌非干細(xì)胞（BCNSC）相比在膀胱癌干細(xì)胞（BCSC）中差異表達(dá)的circRNA,，lncRNA和mRNA，并進(jìn)一步探究了circRNA_103809的功能,。同時(shí),，作者也對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)circRNA、lncRNA等進(jìn)行了通路分析和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）,。

Cancer stem cell-specific expression profiles reveal emerging bladder cancer biomarkers and identify circRNA_103809 as an important regulator in bladder cancer

癌癥干細(xì)胞特異性表達(dá)譜揭示了新興的膀胱癌生物標(biāo)志物,，并確定circRNA_103809為膀胱癌的重要調(diào)節(jié)物

一、研究背景

膀胱癌（BC）是全球最具威脅的惡性腫瘤之一,，發(fā)病率和死亡率很高,。最近的研究表明腫瘤干細(xì)胞有調(diào)節(jié)分化、自我更新,、耐藥的作用,，這意味著它們?cè)诎┌Y的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中可能有重要的地位，然而,，膀胱癌干細(xì)胞（BCSCs）的潛在分子機(jī)制,，尤其是表觀遺傳學(xué)特征，仍然有待探索,。

lncRNA（長(zhǎng)鏈非編碼RNA）與circRNA（環(huán)狀RNA）同樣在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮較大的作用,，例如，差異表達(dá)的lncRNA可以通過(guò)順式或反式調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)發(fā)揮其功能,，從而促進(jìn)乳腺癌,，肺癌和結(jié)腸直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；而circRNA可以作為miRNA的sponge發(fā)揮作用,，因此也可以抑制其功能,。

二、分析流程

三,、結(jié)果解讀

1,、BCSC中mRNA，lncRNA和circRNA的差異表達(dá)情況

之前的研究表明,，單克隆抗體BCMab1與CD44結(jié)合使用時(shí)可用于分離人膀胱癌干細(xì)胞,，為了鑒定與BCSCs功能相關(guān)的基因，作者對(duì)從三名BC患者中分離出的BCSCs（BCMab1 + CD44 +）和BCNSCs（BCMab1-CD44-）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組微陣列分析,。在經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理后,，作者構(gòu)建了3對(duì)BCSCs和BCNSCs樣本的表達(dá)矩陣。圖1為獲取差異表達(dá)情況的方法,?；鹕綀D則用于展示BCSC和BCNSC之間的mRNA,、lncRNA和circRNA的表達(dá)差異（見(jiàn)圖2，p＜0.05,，log2FC＞1）其中紅點(diǎn)表示差異表達(dá)的RNA,。

圖1：獲取表達(dá)情況的流程

圖2：mRNA、lncRNA,、circRNA的差異表達(dá)火山圖

層次聚類(lèi)分析展示了這些RNA在不同樣本中的表達(dá)（圖3），從圖3聚類(lèi)分析的結(jié)果中可以看出這些RNA在樣本的表達(dá)存在系統(tǒng)性差異,，表明BCSC中的mRNA,，lncRNA和circRNA的表達(dá)與BCNSC中的表達(dá)不同。

圖3：層次聚類(lèi)分析的結(jié)果

2,、膀胱癌非編碼RNA的結(jié)構(gòu)特征和染色體分布

在鑒定出差異表達(dá)的lncRNA和circRNA后,，作者自然想到了研究這兩種RNA共同的結(jié)構(gòu)特征以及在染色體的分布情況，從而為下一步的研究埋下伏筆,。為了探究這兩種非編碼基因在膀胱癌細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)特征,，作者對(duì)在該微陣列中檢測(cè)到的lncRNA和circRNA的基因結(jié)構(gòu)和序列保守性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,，基因間和天然反義lncRNA在所有表達(dá)的lncRNA中構(gòu)成最多（圖4A）外顯子和內(nèi)含子circRNA在所有表達(dá)的circRNA中構(gòu)成最多（圖4B）從圖4A中可以看到,，作者根據(jù)鄰近基因的基因組位點(diǎn)把篩選得到的lncRNA分為六個(gè)種類(lèi)，列的灰色部分和黑色部分分別表示BCSC中上調(diào)和下調(diào)的lncRNA,。圖4B同理（只不過(guò)分為了5種）

此外,，分析circRNA在24條染色體（22個(gè)常染色體和2條性染色體）上的分布表明，在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)的circRNA主要分布在chr1和chr17上（圖4C）

圖4：結(jié)構(gòu)特征和染色體的分布情況

3,、驗(yàn)證差異表達(dá)的mRNA,，lncRNA和circRNA

為了驗(yàn)證之前篩選的效果，作者從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇6種mRNA,，lncRNA和circRNA,，并進(jìn)行in vitro驗(yàn)證普遍認(rèn)為，在添加了特定生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中形成懸浮液的細(xì)胞能顯示出較高的干細(xì)胞特性,，所以懸浮液形成培養(yǎng)被認(rèn)為是體外富集癌干細(xì)胞的有效方法,。因此，作者通過(guò)懸浮液形成培養(yǎng)從兩個(gè)膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ中富集了膀胱癌干細(xì)胞,。通過(guò)與微陣列篩選得到的RNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較,，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)趨勢(shì)與微陣列分析結(jié)果一致（圖5）

圖5：在兩個(gè)細(xì)胞系中驗(yàn)證差異表達(dá)的RNA

4、circRNA_103809可作為miR-511的sponge并誘導(dǎo)膀胱癌進(jìn)展

為了進(jìn)一步探究在BCSC中鑒定的差異表達(dá)非編碼RNA的功能,，作者選取了circRNA_103809進(jìn)行研究,。circRNA_103809是高度表達(dá)的環(huán)狀RNA中變異最大的基因，之前的報(bào)道表明,，circRNA_103809在肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)中起著重要作用,。在這篇文章中,，作者用siRNA敲除了膀胱癌細(xì)胞的circRNA_103809，并用qRT-PCR驗(yàn)證了敲除效果,。（圖6A）結(jié)果表明,，circRNA_103809的沉默顯著降低了膀胱癌細(xì)胞的形成，遷移和侵襲能力（圖6B–6D）

圖6A：qRT-PCR分析siRNA轉(zhuǎn)染EJ細(xì)胞的效率

圖6B-D：敲除該RNA對(duì)癌細(xì)胞的影響

上述這些發(fā)現(xiàn)表明,，circRNA_103809的低表達(dá)可以抑制膀胱癌的發(fā)展,。接下來(lái)，為了驗(yàn)證circRNA_103809是否是miRNAsponge,，作者用Arraystar預(yù)測(cè)了circRNA / miRNA的相互作用,。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，circRNA_103809可能與五個(gè)miRNA相互作用,。為了驗(yàn)證circRNA_103809是否與這些miRNA結(jié)合,，作者在EJ細(xì)胞系中進(jìn)行了RNA pulldown實(shí)驗(yàn)，如圖6E所示,，作者首先確定了miRNA在EJ細(xì)胞系中的表達(dá),。然后使用circRNA_103809探針pull-down不同的miRNA，發(fā)現(xiàn)circRNA_103809在EJ細(xì)胞系中僅特異性富集了miR-511（圖6F）,。所有這些實(shí)驗(yàn)證明,，circRNA_103809可以作為miR-511的sponge

圖6E-F：RNA pulldown實(shí)驗(yàn)

5、差異表達(dá)RNA的生物學(xué)過(guò)程和通路富集

為了探究BCSCs中受差異表達(dá)的lncRNA,，circRNA和mRNA影響的生物學(xué)過(guò)程,，作者對(duì)lncRNA的鄰近蛋白編碼基因，circRNA的前體轉(zhuǎn)錄物和mRNA構(gòu)成的基因集分別進(jìn)行了通路和功能富集分析,。

• GO的BP分析表明,，mRNA影響的生物學(xué)過(guò)程為對(duì)化學(xué)刺激的感受，羧酸代謝過(guò)程和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑,；lncRNA影響的生物學(xué)過(guò)程為乙醇氧化,，神經(jīng)支配，微管聚合的正調(diào)控,，白介素7介導(dǎo)的信號(hào)通路和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生的正調(diào)控,；circRNA影響的生物學(xué)過(guò)程為受體循環(huán)，消化道形態(tài)發(fā)生,，高爾基體內(nèi)小泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn),，高爾基體向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，小泡介導(dǎo)的向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn),。

• GO的CC分析表明,，mRNA涉及的細(xì)胞組成有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，細(xì)胞質(zhì)部分,，囊泡,，細(xì)胞周邊和線粒體,；lncRNA涉及的細(xì)胞組成為組蛋白脫乙酰基酶復(fù)合物,，紡錘體微管和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)兩扇區(qū)ATPase復(fù)合物,；circRNA涉及的細(xì)胞組成為皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，特定顆粒內(nèi)腔,，纖毛尖端和纖毛基底,。

• GO的MF分析表明，mRNA調(diào)控的分子功能為轉(zhuǎn)錄激活子活性,，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合,，G蛋白偶聯(lián)受體活性和類(lèi)固醇羥化酶活性；lncRNA調(diào)控的分子功能為醇脫氫酶活性,，類(lèi)固醇脫氫酶活性等；circRNA調(diào)控的分子功能為雙鏈RNA結(jié)合和磷脂酰肌醇4,5雙磷酸結(jié)合,。

• KEGG通路分析的結(jié)果如圖7所示