|
PCR技術(shù)原理與應(yīng)用
一,、實驗?zāi)康模?/span> 1、理解PCR的技術(shù)原理,；2,、了解PCR的應(yīng)用領(lǐng)域 二,、實驗原理： 1 概念 PCR（Polymerasechain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程,，對特定DNA序列進行大量擴增的一種技術(shù),。 PCR反應(yīng)是以4種dNTP為底物，引物引導(dǎo),，DNA聚合酶催化作用下,，在單鏈DNA模板3’末端開始進行互補鏈的延伸，多次反復(fù)的擴增使特定DNA序列以指數(shù)增加,。 2,、PCR反應(yīng)體系 參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為包括：引物、酶,、dNTP,、Buffer、模板和Mg2+,。 2.1 引物 引物是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段,，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置,。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補,，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng). 引物設(shè)計一般考慮以下幾個方面： 2.1.1 引物長度 PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。 引物的長度一般為15-30bp,，常用的是18～27bp,，最佳為20～24bp。引物過短時會造成Tm值過低,，在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對,；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應(yīng)的最適溫度,，還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。 2.1.2 引物堿基構(gòu)成 引物中四種堿基的分布最好是隨機的,，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在,，3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因為這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā),。兩個引物中（g+c）%含量應(yīng)盡量相似,，在已知擴增片段（g+c）%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳,，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),。Tm值是一定鹽濃度條件下,，50%寡核苷酸互補雙鏈解鏈的溫度。Tm=4（G+C）+2（A+T）,。 兩條引物之間避免有同源序列,，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點,；同樣,，引物與待擴增目標(biāo)DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則,，引物就會與其它位點結(jié)合,，使特異擴增減少，非特異擴增增加,。 2.1.3引物二級結(jié)構(gòu) 引物應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的二級結(jié)構(gòu),，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物自身形成的二級結(jié)構(gòu)包括二聚體,、發(fā)卡結(jié)構(gòu),、引物間二聚體等，會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率,。特別是在引物的3’末端,，盡量避免出現(xiàn)這些二級結(jié)構(gòu)。 2.1.4引物3’端序列 DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸,，所以,，引物3’端5～6個堿基與目標(biāo)DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴增,。正,、反向引物互相不能互補，尤其是在3’末端,，否則容易形成引物二聚體,。 引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG,。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對值不超過9）,，負(fù)值大,，則3’末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高,。引物的3’端的?G值過高,，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。 如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位,，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,，會影響擴增特異性與效率。應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A,，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基,。 2.1.5引物的5′端 引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大,。因此,，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點,；標(biāo)記生物素,、熒光、地高辛,、Eu3+等,；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點,、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等,。對于引入一至兩個酶切位點，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計完畢后確定,，便于后期的克隆實驗,，特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。 2.1.6引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源,，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列,。 2.2 DNA聚合酶 Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水棲高溫菌（Thermus aquaticus）中分離的,，由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成。dna聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用,，以DNA為模板,，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3’末端。二是有3’→5’外切酶活力,，能識別和消除錯配的引物末端,，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力,，它能從5’端水解核苷酸,，還能經(jīng)過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸,。在體外實驗中,，Taq DNA聚合酶的出錯率為10-4～10-5。 Taq DNA聚合酶具有以下特點： （1）耐高溫，在70℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性在90%以上,，在93℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性是仍能保持60%,，而在95℃下反應(yīng)2小時后為原來的40%。 （2）在熱變性時不會被鈍化,，故不必在擴增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶,。 （3）一般擴增的PCR產(chǎn)物長度可達2.0 kb，且特異性也較高,。 一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u（總反應(yīng)體積為50ml時）,，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。 2.3 dNTP dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200mmol/l,， 4種dNTP的濃度要相等,。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低,。 2.4 模板DNA 模板DNA的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。特別是以基因組DNA作為模版時,，DNA提取過程中未去除干凈的蛋白質(zhì),、糖類、脂類,、酚類及各種離子等雜質(zhì),，會干擾PCR擴增反應(yīng)，影響PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量,。 模板DNA過高或過低都會影響PCR實驗的結(jié)果,。
2.5 Mg2+ 在PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mmol/l時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜,。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴增,，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。 一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液,，其中已含有一定濃度的Mg2+。在PCR反應(yīng)體系中可以根據(jù)具體情況添加一定量的Mg2+,。 3 PCR反應(yīng)流程 PCR循環(huán)過程包括三部分：模板變性,、引物退火,、DNA鏈延伸合成。 3.1 模板DNA的變性 模板DNA加熱到90~95℃時,，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂,，雙鏈解開成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,。變性溫度低則變性不完全,，dna雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量,。變性溫度不能過高,，變性時間應(yīng)盡量縮短，以保持taqdna聚合酶的活力,。PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,、G-C含量高低等均有關(guān)。G-C間由三個氫鍵連接,，而A-T間只有兩個氫鍵相連,，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高,。對于高G-C含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO）,，并且在PCR循環(huán)中起始階段進行熱啟動。 3.2 模板DNA與引物的退火 將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時,，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交,，形成DNA模板-引物復(fù)合物，即復(fù)性,。退火溫度決定PCR產(chǎn)物的特異性與產(chǎn)量,。退火溫度高，特異性強,，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合,，DNA擴增效率下降；退火溫度低產(chǎn)量高,，但過低可造成引物與模板錯配,，非特異性產(chǎn)物增加。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成,。一般實驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的解鏈溫度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：Ta =Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃,。在反應(yīng)體系中引物的濃度大大高于模板DNA的濃度,，并且引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時,，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多,。退火時間一般為1～2min。 3.3 引物的延伸 DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈,。引物延伸溫度的選擇取決于DNA聚合酶的最適溫度, 一般為70～75℃,。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。一般在72℃條件下,，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個堿基/秒,其速度取決于緩沖溶液的組成,、ph值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì),。 PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行,，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用Y＝（1＋X）n計算,。 Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),，X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù),。平均擴增效率的理論值為100%,。反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)形式,，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期,，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,，這種效應(yīng)稱平臺效應(yīng)。 PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分,。引物如果跟原始DNA模板結(jié)合,，從3'端開始擴增延伸，其產(chǎn)物的5'端是固定的,，3'端則沒有固定的止點,，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”,。引物如果是以新合成的DNA鏈（即“長產(chǎn)物片段”）為模板擴增時,，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸鏈的3'端是固定的,，使新合成DNA鏈的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi),、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。由于新合成的DNA鏈在下一個循環(huán)反應(yīng)中可以作為引物結(jié)合擴增的模板,，“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加,。而原始DNA模版的量是固定的,，“長產(chǎn)物片段”只按算術(shù)倍數(shù)增加，在最終PCR中的含量幾乎可以忽略不計,。 一般PCR反應(yīng)包括上述變性-退火-延伸三個溫度點,。但在擴增某些較短目標(biāo)序列（長度為100～300bp時）時，可采用二溫度點法,，即把退火與延伸溫度合二為一,。 3.4 循環(huán)次數(shù) PCR循環(huán)次數(shù)一般為25～40個。循環(huán)次數(shù)過多,，非特異性背景嚴(yán)重,，復(fù)雜度增加。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少,，則產(chǎn)率偏低,。 4 PCR反應(yīng)特點 4.1強特異性 PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： （1）引物與模板DNA特異性的結(jié)合； （2）堿基配對原則,； （3）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性,； （4）目標(biāo)基因序列的特異性與保守性。 4.2 高靈敏度 在以基因組DNA為模板進行PCR擴增時,，其靈敏度可達到白萬分之一,。 4.3 快速簡便 PCR反應(yīng)可在PCR儀上進行，一般在2～4小時完成,。如采用特殊PCR儀（熒光時時定量PCR儀）則可全程監(jiān)測PCR反應(yīng)的結(jié)果,，故耗時將更短。 5 應(yīng)用領(lǐng)域 5.1 PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 5.1.1特定DNA序列的克隆與重組子的鑒定 5.1.2 DNA的體外定點突變與分析 5.1.3染色體DNA的引物原位雜交 5.1.4 DNA洗牌術(shù)（Shuffling） 5.2 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 5.2.1檢測病原體 5.2.2臨床疾病診斷 |
|
|
