PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具 有特異,、敏感,、產(chǎn)率高、 快速,、 簡便,、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點,。 　　PCR技術(shù)最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的,；最早的應(yīng)用報道是Saiki等1985年將PCR技術(shù)應(yīng)用于β-珠蛋白基因擴增和鐮刀狀紅細胞貧血的產(chǎn)前診斷。隨后使用了1976年Chien等分離的熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶,，使PCR操作大為簡化,，并使PCR自動化成為可能；1987年Kary Mullis等完成了自動化操作裝置,，使PCR技術(shù)進行實用階段,。 　　復(fù)旦大學(xué)1988年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬立人教授等在1989年研制成功了PCR自動裝置,，并且不斷推陳出新,，最近研制的PTC-51A/B型DNA熱循環(huán)儀體積小，造型美觀,，價格適宜,，操作簡單，尤為適宜國內(nèi)應(yīng)用,。 　　PCR發(fā)明不到10年,，卻已獲得廣泛應(yīng)用,。每年都有上千篇文章　發(fā)表。1991年,，期刊“PCR方法與應(yīng)用”（PCr Methods and Application）在美國創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊,。PCR技術(shù)作為一種方法學(xué)革命,，必將大大推動分子生物學(xué)各有關(guān)學(xué)科的研究，使其達到一個新的高度,。 　　1993年度諾貝爾化學(xué)將已于10月13日揭曉,，Kary Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得此殊榮。現(xiàn)在世界各地都在使用PCR檢測病人血液中的微量遺傳物質(zhì),，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路,。瑞典皇家科學(xué)院說：“PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中。該方法同DNA測序法結(jié)合起來很可能將成為研究動植物分類學(xué)的一種革新工具,。”一名加拿大籍英國科學(xué)家Michael Smith因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮,。

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原理

　　PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法，主要由高溫變性 ,、 低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫（95℃）下,，待擴增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下,，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合,，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下,，以引物3’端為合成的起點,，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸,，合成DNA新鏈,。這樣，每一雙鏈的DNA模板,，經(jīng)過一次解鏈,、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子,。如此反復(fù)進行,，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍,，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增,，經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上,，實際上一般可達106～107倍,。 　?。模危潦怯伤姆N堿基按互補配對原則（即腺嘌呤Ａ對胸腺嘧啶Ｔ，鳥嘌呤Ｇ對胞嘧啶Ｃ）組成的螺旋雙鏈,。在細胞內(nèi),，ＤＮＡ復(fù)制時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板,，然后,，另一種酶－－ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）結(jié)合到ＤＮＡ模板上，最后,，ＤＮＡ合成酶以這段引物為起點,，合成與ＤＮＡ模板配對的新鏈。ＰＣＲ即是在體外模擬ＤＮＡ復(fù)制的過程,，它用加熱的辦法讓所研究的ＤＮＡ片段變性變成兩條單鏈,，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到ＤＮＡ模板的兩端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量復(fù)制該模板,。 　　假設(shè)擴增效率為“X”,，循環(huán)數(shù)為“n”，則二者與擴增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為：y=(1 X)n,。擴增30個循環(huán)即n=30時,，若X=100%，則y=230=1073741824(>109),；而若X=80%時,，則y=1.830=45517159.6(>107)。由此可見,，其擴增的倍數(shù)是巨大的,，將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色,，在紫外灶照射下（254nm）一般都可見到DNA的特異擴增區(qū)帶,。

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反應(yīng)體系

一、PCR操作范例

　　PCR基本原理示意圖（如右圖）： 　　在一個典型的PCR反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液,、微量的 模板DNA,、4×dNTPs、耐熱性多聚酶,、Mg2 和兩個合成的DNA引物,。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min,，72℃延伸2min,。在首次循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上,，確保擴增的DNA為雙鏈DNA,。為便于了解PCR反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件,，使人們以此為基礎(chǔ),，對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應(yīng)條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考,。

二,、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

（一）PCR緩沖液（PCrBuffer）

　　用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見PCR操作范例。于72℃時,，反應(yīng)體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2,。二價陽離子的存在至關(guān)重要,，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明,，Mg2 優(yōu)于Mn2 ,，而Ca2 無任何作用。 　　1．Mg2 濃度Mg2 的最佳濃度為1.5mmol/L（當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時）,，但并非對任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的,。首次使用靶序列和引物結(jié)合時，都要把Mg2 濃度調(diào)到最佳,，其濃度變化范圍為1～10mmol/L,。Mg2 過量易生成非特異性擴增產(chǎn)物，Mg2 不足易使產(chǎn)量降低,。 　　樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根,，會與Mg2 結(jié)合而降低Mg2 有效濃度。因此,，用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中,。 　　dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2 的有效濃度,。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L,，低于1.5mmol/L的Mg2 濃度。因此,，在高濃度DNA及dNTP條件時,，必須相應(yīng)調(diào)整Mg2 的濃度。 　　2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液,，很少使用其他類型的緩沖液,。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.0 21/℃,。因此,，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時,，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間,。 　　3．KCl濃度K 濃度在50mmol/L 時能促進引物退火,。但研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時,，KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性,，少加或不加KCl對PCR結(jié)果沒有太大影響。 　　4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用,。一般用量為100μg/ml,，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果,，影響不大,。 　　5．二甲基亞砜（DMSO）在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級結(jié)構(gòu),，使（G C）%含量高的模板易于完全變性,，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性,，因此,，大多數(shù)并不使用DMSO。

（二）四種脫氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）

　　在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性,，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入,，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯誤摻入，而濃度太低,，勢必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量,。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L,。四種dNTP的濃度應(yīng)相同,，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導(dǎo)聚合酶的錯誤摻入,，降低合成速度,，過早終止反應(yīng)。 　　決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成,，例如,，在100μl反應(yīng)體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L,，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。 　　購自廠商的dNTP溶液一般均未調(diào)pH,，應(yīng)用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0,，以保證反應(yīng)的pH值不低于7.1。市購的游離核苷酸凍干粉,，溶解后要用NaOH中和,，再用紫外分光光度計定量。

（三）引物的量

　　引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在0.1～1μmol/L之間,。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物,。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟、特異,，但濃度過低,，不足以完成30個循環(huán)的擴增反應(yīng)，則會降低PCR的產(chǎn)率,。

（四）TaqDNA聚合酶的量

　　典型PCR反應(yīng)混合物中,，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl,。由于DNA模板的不同和引物不同,，以及其它條件的差異,，多聚酶的用量亦有差異,，酶量過多會導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。 　　由于生產(chǎn)廠家所用兵配方,、制造條件以及活性定義不同,，不同 廠商供應(yīng)的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。 　　Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下,，于74℃,，30min內(nèi)使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min,，折算成30min摻入量,。 　　分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3.25℃），50mmol/l KCl,，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巰基乙醇）,，dATP、dTTP,、dGTP各200mmol/L,，dCTP為100mmol/L(由不標(biāo)記及α-32P標(biāo)記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA,，最終體積50μl,。

（五）模板

　　單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA,，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA,。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA,，但為了保證反應(yīng)的特異性,，還應(yīng)用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料,，模板可以是粗品,，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶,、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白,。 　　DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時）,，如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化,，則擴增效果更好。閉環(huán)靶序列DNA的擴增效率略低于線狀DNA,，因此,，用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時最好先將其線狀化。 　　模板靶序列的濃度因情況而異,，往往非實驗人員所控制,，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng，0.1ng,，0.001ng等）,，設(shè)置一組對照反應(yīng)，以檢測擴增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求,。

（六）石蠟油

　　PCR擴增時建議在混合物上面鋪一層石蠟油,，減少PCR過程中尤其是變性時液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。研究表明,，應(yīng)用石蠟油可使擴增產(chǎn)量增加5倍,，可能與石蠟油維持熱恒定和整個反應(yīng)體系中鹽濃度有關(guān)。

三,、電泳分析

　　在實際工作中常采用瓊脂糖凝膠電泳,。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠（EB）（每100ml加100μl），然后將已經(jīng)制備好的1%～2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制）放入電泳槽內(nèi),，加入待測樣品10μl,，同時用分子量標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)記。瓊脂糖濃度應(yīng)按分離DNA片段的大小進行選擇,，一般用1.5%～2%,，電泳電壓75V,，待樣品進行凝膠內(nèi)距膠末端1cm時，切斷電源,，取出凝 膠在紫外燈下直接觀察結(jié)果,。 　　由于溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光,，使EB的熒光強度增強80～100倍,，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察,。一般肉眼觀察DNA量可達10ng,，其熒光強度與DNA含量成正比。 　　DNA分子在凝膠中泳動速度決定于電荷效應(yīng)及分子效應(yīng),。前者由所帶凈電荷量決定,，而后者與分子大小及構(gòu)型有關(guān),。按照DNA分子大小,，其凝膠濃度可做不同的調(diào)整,。有條件的實驗室也可用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析擴增的DNA片段。

四,、影響PCR的主要因素

　　PCR技術(shù)必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA,，然后才進行自動熱循環(huán)，最后進行產(chǎn)物鑒定與分析,。引物設(shè)計與合成目前只能在少數(shù)技術(shù)力量較強的研究院,、所進行，臨床應(yīng)用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作,，PCR自動熱循環(huán)中影響因素很多,，對不同的DNA樣品,，PCR反應(yīng)中各種成份加入量和溫度循環(huán)參數(shù)均不一致?，F(xiàn)將幾種主要影響因素介紹如下。 　　一,、溫度循環(huán)參數(shù) 　　在PCR自動熱循環(huán)中,，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示,，其變性,、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,，共25～30個循環(huán),，擴增片段500bp。在這里,，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達到所要求的溫度后開始計算,。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s,，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型,、壁厚,、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差,，在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮,，對每一儀器均應(yīng)進行實測。 　　關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離,；距離越遠,，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的,。下面就各種溫度的選擇作一介紹,。 　　1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板,，PCR也就不會啟動,。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性,，因而減少產(chǎn)量,。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度,。DNA變性只需要幾秒種,，時間過久沒有必要；反之,，在高溫時間應(yīng)盡量縮短,，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃,。 　　2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量,；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合,，DNA擴增效率下降,；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配,，非特異性產(chǎn)物增加,。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng),，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度,。也可根據(jù)引物的（G C）%含量進行推測，把握試驗的起始點,，一般試驗中退火溫度比擴增引物的融解溫度TTm低5℃,，可按公式進行計算： 　　Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃ 　　其中A,，T，G,，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù),。例如，20個堿基的引物,，如果（G C）%含量為50%時,，則Ta的起點可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成,，長時間退火沒有必要,。 　　3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃,，在72℃時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達35～100個核苷酸/秒,。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成,、pH值,、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴增片段如短于150bp,，則可省略延伸這一步,，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成,。對于100～300bp之間的短序列片段,，采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的,。此時,，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DNA片段,，可根據(jù)片段長度將延伸時間控制在1～7min,，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑,，使Taq DNA聚合酶在長時間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性,；15%～20%的甘油有助于擴增2.5kb左右或較長DNA片段,。 　　4．循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個周期,。一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重,，復(fù)雜度增加,。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低,。所以,，在保證產(chǎn)物得率前提下,，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。 　　擴增結(jié)束后,，樣品冷卻并置4℃保存,。 　　二、引物引物設(shè)計 　　要擴增模板DNA,，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物,，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段,，兩引物間距離決定擴增片段的長度,，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。由此可見,，引物是決定PCR擴增片段長度,、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要,。 　　引物設(shè)計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的,，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個堿基,，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補的二條引物,，除此之外，引物設(shè)計一般遵循的原則包括： 　　1．引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算,，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機率的為1次,。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸,，而最高不超過30個核苷酸,，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72℃）下不會形成穩(wěn)定的雜合體,。有時可在5’端添加不與模板互補的序列,，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要,；引物5’端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測等各種目的,。有時引物不起作用，理由不明,，可移動位置來解決,。 　　2．（G C）%含量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體,。兩個引物中（G C）%含量應(yīng)盡量相似,，在已知擴增片段（G C）%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳,。 　　3．引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級結(jié)構(gòu),，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructures）,。例如： 　　4．引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在引物3’端,，即使無法避免,，其3’端互補堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer）,。所謂引物二聚體實質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下,，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品,，有時甚至成為主要產(chǎn)物,。 　　另外，兩條引物之間避免有同源序列,，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段,，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣,，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列,。否則，引物就會與其它位點結(jié)合,，使特異擴增減少,，非特異擴增增加。 　　5．引物3’端配對DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸,，所以,，引物3’端5～6個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴增,。 　　引物設(shè)計是否合理可用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進行計算機檢索來核定,。 　　人工合成的寡核苷酸引于最好經(jīng)過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì),。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長,；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20℃冰箱中,，在液體中引物能保存6個月,，凍干后可保存1～2年。 　　三,、DNA聚合酶 　　在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶,，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成,，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段,，一個片段分子量為76000，有聚合酶活性,，并有3’→5外切酶活力,，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個片段分子量為34000,，具有5’→’3’外切酶活力,。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用,，以DNA為模板,，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力,，能識別和消除錯配的引物末端,，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力,，它能從5’端水解核苷酸,，還能經(jīng)過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸,。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法,，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進行PCR,，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展,。人們從生活于60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度,，所以無法應(yīng)用于PCR,。 　　1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度,，所以每次循環(huán)都要加入新酶,；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作,，同時使退火和延伸溫度得以提高,，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級結(jié)構(gòu)對PCR的干擾，增進了PCR特異性,、產(chǎn)量和敏感度,，二者相比，其主要區(qū)別在于：①Klenow酶的最適溫度為37℃,，擴增的產(chǎn)物并非全是目的序列,，需用探針檢測。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高,。它的最適溫度為74～75℃,。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯配引物的延伸,。②循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡,。到達平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個（均用1μg基因組DNA開始）而Taq酶為30個,。③延伸片段長度Taq酶為10kb以內(nèi),，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。 　　Taq酶由水棲高溫菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分離而得,。此菌于1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉,，作為棲熱桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生長溫度為70～75℃,。最初從中分離到分子量60～68KDa,，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶,，分子量為93910,。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結(jié)合率（Kcat）可達150核苷酸（nt）/s酶分子,。以M13模板,，用富含G C的30bp引物延伸，70℃時Kact>60nt/s,；55℃可達24nt/s,；37℃時為1.5nt/s，而22℃時低至0.25nt/s,。高于90℃時DNA合成活性甚差,，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合,。 　　在PCR反應(yīng)混合液中,，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時間分別為130、40及5～6min,，在50次循環(huán)的PCR中當(dāng)管內(nèi)最高溫度為95℃,。每循環(huán)為20s時尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min,，故在PCR循環(huán)中選用的變性溫度,，不宜高于95℃。 　　Taq酶現(xiàn)已可用基因重組的方法生產(chǎn),，商品名為Ampli Taq（Cetus公司）,。Taq酶的完整基因長2499bp，在大腸桿菌中表達生產(chǎn),，含832個氨基酸,。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對dNTP結(jié)合，引物與模板作用區(qū)均存在于Taq酶中,。 　　Taq酶具有依賴DNA合成的5’→’3’外切酶活性,，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻斷物”,，會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸,，而對于5’-32P標(biāo)記的合成寡核苷酸引物,，則無論是單鏈或是與模板復(fù)性,，都未發(fā)現(xiàn)降解，所以該種活性不會影響PCR結(jié)果,。Taq酶沒有3’→’5’外切酶活性,，如果發(fā)生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力,，因此運用Taq酶進行PCR,，產(chǎn)物中點突變較多，對克隆等不太有利,。一般錯摻率為1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L,，Mg2 為1.5mmol/L，在55℃退火),。但不含3’→5’外切酶活性對測序有利,。 　　2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 離子的影響。用鯡精DNA為模板,，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg2 為2.0mmol/L時激活能力最高,。濃度超過此值產(chǎn)生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力達40%～50%,。dNTP能與Mg2 結(jié)合,，故游離Mg2 只是結(jié)合后剩余的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時,，Taq酶活力要降低20～30%,，即底物抑制。 　　dNTP濃度低時PCR產(chǎn)率及特異性均增高,，適合于用擴增摻入法標(biāo)記生物素及放射性元素,。當(dāng)100μl　PCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。 　　用鯡精DNA,，70℃,，10min內(nèi)dNTP的摻入量計算，標(biāo)準(zhǔn)條件為100%,。 　　純9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力,。誤摻入率取決于dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5’→3’核酸外切酶活力。對5’→3’32P標(biāo)記寡核苷酸單鏈,，或與MB模板雜交時均只有極少的降解力,。 　　中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L,，濃度更高有抑制作用,，>200mmol/L的KCl可使酶失活。 　　加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可產(chǎn)生中度抑制或無作用,。 　　低濃度尿素,、DMSO、DMF或甲酰胺影響不大,，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用,。 　　3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289個氨基酸）去除，稱為stoffel片段,。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min,，同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應(yīng)即復(fù)合PCR（Multiplex PCR）更為有利。 　　VentTMDNA多聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent）中分離的超級嗜熱菌-能生長于98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的,，故名Vent酶,。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力,，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力,，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。后來該公司又從深水潛艇（2010m）排氣孔分離的能在104℃生長的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶,，在95℃的半壽期達23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h）,。 　　4．RTth逆轉(zhuǎn)錄酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）的發(fā)展很快，所以對耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進展,。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴于RNA的DNA聚合酶活性,，但活性較弱。Cetus公司于1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性,，二種活性分別依賴于Mn2 Mg2 ,，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進行RT-PCR,，得到特異的DNA片段,，從而非常有利于逆轉(zhuǎn)錄PCR的發(fā)展。 　　耐熱DNA聚合酶的研究得到長足的發(fā)展,，這在PCR發(fā)展中起到了重要的作用,。相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應(yīng)用更進一步地發(fā)展,。 　　我國的PCR研究發(fā)展很快,，其關(guān)鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化,，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所、華美公司,、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,。后二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化,，復(fù)旦大學(xué)遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因并獲得了耐熱F4DNA聚合酶,，其酶學(xué)性質(zhì)非常接近于Taq DNA聚合酶，為中國PCR的開展提供了保證,。 　　四,、影響PCR特異性的因素 　　通過上述內(nèi)容?？梢钥闯鲇性S多因素可以影響PCR的特異性,，在此我們作一歸納,，供大家參考：①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交,，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸,。③引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品,，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化,。④改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進特異性,，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級結(jié)構(gòu),，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時,，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP,，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成,。 　　五、擴增平坡 　　擴增反應(yīng)并不是可以無窮地進行下去的,，經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進入平坡,；進入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量,。所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期,，合成產(chǎn)物達0.3～1pmol時，由于產(chǎn)物的堆積,，使原來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線,。造成PCR進入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活,，這幾中因素在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中均不會出現(xiàn),。此外,，還有幾種可能： 　　1．底物過剩因DNA合成量多于反應(yīng)液中存在的Taq酶，在100μl反應(yīng)液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達1μg（3nmol脫氧核苷酸）時,，開始變?yōu)榈孜镞^剩,。延長延伸時間或添加Taq酶，可以克服之,。但不實用,，因每進行下一循環(huán)就要延長延伸時間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續(xù)保持指數(shù)增長,。 　　2．非特異性擴增產(chǎn)物的競爭與上述情況密切相關(guān),，此時不需要的DNA片段與需要的片段同時競爭聚合酶，要克服這一情況是要提高反應(yīng)特異性,，使不需要片段不能大量積聚,。 　　3．退火時產(chǎn)物的單鏈自己締合兩條單鏈的DNA片段在退火時除了與引物締合外，也可以自行締合,，這也會阻止產(chǎn)品增多,。當(dāng)產(chǎn)物濃度到達10pmol/100μl時即可發(fā)生此現(xiàn)象，除稀釋外無法克服,。 　　4．變性在高濃度產(chǎn)物條件下,，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸化,，雙鏈DNA）,。 　　總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的,，并無統(tǒng)一的最佳條件,，先選用通用的條件擴增，然后稍稍改變各參數(shù),，可以達到優(yōu)化,，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。

 

應(yīng)用模式

一,、兼并引物（DegeneratePrimer）PCR

　　密碼子具有兼并性,，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的，但可以設(shè)計成對兼并引物,，擴增所有編碼已知順序的核酸序列,。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應(yīng)相同,。兼并度越低,，產(chǎn)物特異性越強，設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸,，并避免引物3’末端兼并,，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增,、克隆和序列分析。現(xiàn)已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因,、糖尿病相關(guān)肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因,。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物進行PCR,，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基,，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。

二,、套式引物（NestedPrimer）PCR

　　用第一套引物擴增15～30個循環(huán),，再用擴增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴增15～30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到高效擴增,，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴增,。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除第一引物,。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細胞AS52的分子突變,。AS52細胞含有單拷貝的細胞gpt（guanine phos－phribosytransferase）基因，與哺乳動物具有同源性,。套式引物PCR減少了引物非特異性退火,，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率,。對環(huán)境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴增是非常有效的。 　　若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變,，延長外引物長度（至25～30bp）,，同進縮短內(nèi)引物長度（15～17bp），使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴增,，然后改換至三溫循環(huán),，使內(nèi)引物在外引物擴增的基礎(chǔ)上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入,，兩種循環(huán)一氣呵成,，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無異,，在我們最近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序,。套式一次PCR的成功，使PCR檢測的全過程可以在5h內(nèi)完成,，使當(dāng)天出檢驗報告成為現(xiàn)實,，也使PCR檢測走入臨床有了現(xiàn)實的基礎(chǔ)。

三,、復(fù)合PCR（Multiplex PCR）

　　用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR,。這一方法最初是由Chanberlain 等檢測人的基因發(fā)展而來,。Bej等隨之發(fā)展了對環(huán)境樣品中不同屬細菌相關(guān)基因序列同時PCR擴增的檢測方法。兩種不同的軍團菌（legionella）基因,，一為特異嗜肺L基因（mip）,，另一種為L-5SrRNA基因，通過引物搖擺（staggered）添加進行復(fù)合PCR,。首先mip引物PCR擴增7個循環(huán),，然后加入5SrRNA引物PCR擴增38個循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細菌包括E.coli大腸菌,、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌,。 　　在復(fù)合PCR中，所有引物Ta值應(yīng)相近,。如果兩對引物Tq值差異超過±℃10%,，會使擴增產(chǎn)物的量明顯不同，其中一種擴增產(chǎn)物或目的DNA很難觀察到,。另外,，靶DNA的長度也應(yīng)相近，差別大時短片的靶DNA會優(yōu)先擴增,，因此,，會產(chǎn)生不同產(chǎn)量的擴增產(chǎn)物，為此,，須采用DNA搖擺擴增或加入不等量的引物方法進行解決,。

四、反向PCR（Inverse PCR或Reverse PCR）

　　反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA,，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA,。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移,。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補,，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA,，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子,，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針,，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要,。 　　該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段,。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA,。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列,，這樣,，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交,。 　　利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列,，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆,，建立全長的DNA探針。適用于基因游走,、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究,。

五、不對稱PCR（Asymmetric PCR）

　　不對稱PCR的基本原理是采用不等量的一對引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ss-DNA）,。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物,；其最佳比例一般為1：50～1：100，關(guān)鍵是限制引物的絕對量,。限制性引物太多太少,，均不利于制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA（ds-DNA）,，再以ds-DNA為模板,，只用其中一種過量引物進行單引物PCR制備ss-DNA。產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開,，而得到純ss-DNA,。不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cD－NA經(jīng)不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法,。

六,、標(biāo)記PCR（LP-PCR）和彩色PCR

　　LP-PCR（Labelled Primers PCR）是利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進行標(biāo)記,，據(jù)此檢測目的基因的存在與否,，與常規(guī)PCR相比更為直觀，省去了限制性內(nèi)切酶酶切及分子雜交等繁瑣步驟,，而且一次可以同時分析多種基因成分，因而特別適合于大量臨床標(biāo)本的基因診斷,。該方法只對PCR產(chǎn)物進行定性鑒定,。 　　彩色PCR（Colorcomplement assay）直譯為“著色互補性檢測”，是LP-PCR的一種,，彩色PCR意譯更為明確：它用熒光染料標(biāo)記引物的5’端,。熒光染料JOE和FAM呈綠色熒光；TAMRA呈紅色熒光,；COUM呈藍色熒光,。不同熒光標(biāo)記的引物同時參加反應(yīng)，擴增后的目的基因會分別帶有引物5’端的染料,，通過電泳或離心沉淀,，肉眼就可以根據(jù)不同熒光的色澤判斷目標(biāo)基因是否存在及擴增基因的類型,。通常僅需2種不同顏色的引物，一種作為基因檢測引物,；另一種作為控制條件的內(nèi)對照,，即可診斷基因缺失、染色體易位或感染某種病毒,。檢測多種點突變時,，可用更多的色彩，如多點突變的遺傳病,、幾種可疑病毒感染,、HLA位點分析都可以用彩色PCR同時檢測多個位點。

七,、加端PCR

　　加端PCR（add-PCR）是使擴增產(chǎn)物的5’-末端加一段DNA順序的PCR,。設(shè)計加端PCR的引物時，除與模板配對的那一部分外再加上若干堿基,，這樣使擴增產(chǎn)物的末端加上額外一段DNA,，如加上一個限制酶的識別順序或特定功能的DNA片段。Stoflet等報道在結(jié)構(gòu)基因前加上噬菌體T7的啟動子,，當(dāng)然也可用于DNA片段的末端標(biāo)記或引入特定的點突變,。末端可加堿基的數(shù)量與引物的長短有關(guān)，當(dāng)引物足夠長時擴增產(chǎn)物或末端甚至可以加上十幾個到幾十個堿基,。

八,、錨定PCR或固定PCR

　　錨定PCR（AnchoredPCR，A-PCR）主要用于分析具有可變末端的DNA序列,，Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細胞T細胞受體α-鏈的mRNA的多變性進行了分析,。先合成cDNA，并用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在其3’-可變區(qū)末端加上一個PolyG尾巴,。Loh等恒定區(qū)與可變區(qū)連接部位設(shè)一個引物,，另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點,，它可以并與PolyG尾巴結(jié)合,，無論其余部分序列如何，只識別片段末端,，利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列,，每一種都是獨特的，表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結(jié)果,，可用于T細胞,、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。

九、玻片PCR

　　在聚丙烯管中可以對多種含膜板材料進行PCR,，而在顯微玻片上用組織細胞涂片或切片直接進行DNA擴增的方法就稱為玻片PCR（Slide-PCR）,。 　　先將細胞涂片或呈單層細胞，然后用甲醇/醋酸（3：1,，V/V）,、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5～15min,。用蒸餾水沖洗,，干燥，直接使用或保存于-20℃?zhèn)溆?。在玻片上?0mm×28mm為免疫組化反應(yīng)區(qū),。加入30μl PCR反應(yīng)混合液，其中含10mmol/L TrispH8,，3,50mmol/L KCl,，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/l dNTPs,，100nmol/L引物,，0.01%（V/V）明膠，0.2%BSA,，2.5u/100μl Taq酶,。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片，邊緣用石蠟油封好,。把玻片放入PCR熱循環(huán)儀金屬塊上,，使金屬塊與樣品呈最大程度接觸，同在聚丙烯管中一樣,，進行30～40個循環(huán),。對于較短的擴增片段在后期循環(huán)中變性溫度可降低。反應(yīng)后,，將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,，但不取出蓋玻片，用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,，在相對的一角中PCR反應(yīng)混合液呈半月形液面,，用移液器回收。一般可回收25μl混合液,，將反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標(biāo)準(zhǔn)PCR進行重新擴增。片上擴增物可做原位雜交顯示,。 　　在Slide-PCR中,，需0.1%～1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結(jié)果，但效率不一定很高,。明膠（至少0.0001%）,對擴增1kb左右的靶DNA十分重要,。但對小片段擴增結(jié)果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行,。 　　Silde-PCR的機理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來,，然后在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標(biāo)記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環(huán)中DNA極微量,，而30個循環(huán)后很豐富,。常規(guī)細胞染色表明只有少量的形態(tài)改變。 　　Silde-PCR對于玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法,，而不必再把這些樣品從玻片上括下來,，使操作簡便，污染減少,。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的（如子宮頸涂片或涂片）具有實用價值,。

十、反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測RNA

　　RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是以RNA為模板,，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcrip－tion, RT）與PCR,，可用于檢測單個細胞或少數(shù)細胞中少于10個拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測提供了方便,；并為獲得與擴增特定的RNA互補的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑,。 　　RNA擴增包括兩個步驟：①在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補鏈cDNA,；②加熱后cDNA與RNA鏈解離,，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA,，最后擴增靶DNA,。 　　在RT-PCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣,。由于引物的高度選擇性,，細胞總RNA無需進行分級分離，即可直接用于RNA的PCR,。但RT-PCR對RNA制品的要求極為嚴(yán)格,，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA,、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì),。RNA中即使含有極微量的DNA，經(jīng)擴增后也會出現(xiàn)非特異性擴增,；蛋白質(zhì)未除凈,，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品,，尤以后者方法為佳,，適合一般實驗室進行。 　　常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種,，即禽類成髓細胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosis virus, AMV）和莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murineleukemia virus, MO-MLV）的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）,。一般情況下用Mo-MLV-RT較多，但模板RNA的二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄時,，可改用AMV-RT,，因后者最適溫度為72℃，高于Mo-MLV-RT的最適溫度（37℃）,，而較高的反應(yīng)溫度有助于消除RNA的二級結(jié)構(gòu),。 　　一步法擴增（one step amplification）是為了檢測低豐度mRNA的表達，利用同一種緩沖液,，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶,、引物、Taq酶,、4種dNTP直接進行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增,。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性,，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄和其后的PCR擴增,，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化，所需樣品量減少到最低限度,，臨床小樣品的檢測非常有利,。用一步法擴增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cD－NA的克隆,，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合,，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在一個試管中進行,。

十一,、定量PCR

　　1．DNA-PCR定量用同位素標(biāo)記的探針與電泳分離后的PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，根據(jù)放射自顯影后底片曝光強弱可以對模板DNA進行定量,。Abbot等利用這種方法對人類T細胞白血病反轉(zhuǎn)錄基因進行了定量研究,。 　　PCR擴增產(chǎn)物用專為檢測ds-DNA而設(shè)計的微量熒光計定量，利用染料H33258專與雙鏈DNA結(jié)合而使熒光增強50倍的特性,?？梢詮臉?biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋擴增產(chǎn)物量曲線上讀出樣品中模板DNA的量或拷貝數(shù)，達到PCR定量的目的,。 　　利用倍比稀釋模板作系列稀釋PCR,，求出最低（PCR-EB）檢測限來比較,，也是常用的半定量PCR方法。 　　2．mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需經(jīng)兩個酶（RT和Taq）催化,，因而影響因素較多。1989年Wang等報道了低豐度mRNA絕對定量方法,。利用濃度已知且與待測靶mR-NA序列相同的內(nèi)對照mRNA（其片段長短不同,，便于PCR擴增后產(chǎn)物的分離），在同一體系中,，用相同的由32P標(biāo)記的引物與待測mRNA一同進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增,，擴增產(chǎn)物電泳后，分別測定二者產(chǎn)物放射性強度,，由預(yù)先制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每個樣本特異mRNA的量,。Gilliland等的結(jié)果表明，在1ng總RNA中可以對小于1pg的特異mRNA進行定量,。這一定量方法在腫瘤,、代謝失調(diào)、基因表達調(diào)控等研究中均有重要意義,。 　　例如：假定我們要研究的ＤＮＡ雙鏈兩端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA在ＰＣＲ之前,，我們首先人工合成兩段有２０－３０堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對,，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別,，以小寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaacctat,。把這兩段引物和ＤＮＡ模板,、ＤＮＡ聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合在一起,，我們就可以開始做ＰＣＲ了,。 　　第一步叫“變性”，把樣品加熱到９４－９６℃一到數(shù)分鐘,，讓ＤＮＡ模板變性變成單鏈,。 　　第二步叫“退火”，讓樣品的溫度下降到５０－６５℃一到數(shù)分鐘,，引物就可以結(jié)合到模板上去,。 　　TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgtttatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到７２℃一到數(shù)分鐘,，ＤＮＡ聚合酶就可以從引物開始用底物復(fù)制出新鏈,。 　　TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA這樣經(jīng)過三步一個循環(huán)，一條雙鏈就變成了兩條,，再來一個循環(huán),，就變成了四條……在一個由計算機控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個循環(huán),，就可以把原來的樣品精確地擴增了２的３０次方倍，而這只需要兩三個小時,。ＰＣＲ要成功,，必須要有能夠忍耐高溫、在高溫下仍然能有活性的ＤＮＡ聚合酶,。這種酶可從生活在溫泉中的細菌中提取,，其中最常用的一種叫Ｔａｑ聚合酶。野生型的Ｔａｑ聚合酶保真度較差,，在復(fù)制比較長的模板時容易發(fā)生點突變,。通過遺傳工程，我們已獲得了高保真度的Ｔａｑ聚合酶,，大大提高了ＰＣＲ復(fù)制的精確程度,。

 

應(yīng)用實例

　　在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究上，ＰＣＲ被廣泛地用于基因克隆和制造突變,。在臨床醫(yī)學(xué)上,，ＰＣＲ被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染,。用傳統(tǒng)的方法,，要檢測病毒、病菌的感染需要把病原體培養(yǎng)數(shù)周才能鑒定,，而現(xiàn)在用ＰＣＲ,，即可以迅速判斷人體細胞（比如血液細胞）中是否存在病毒、病菌的ＤＮＡ（比如ＨＩＶ的ＤＮＡ）而確診,。 　　在法醫(yī)上,，ＰＣＲ目前已成為發(fā)現(xiàn)罪證的重要方法。比如,，０.１微升的唾液痕跡所含的ＤＮＡ就可以通過ＰＣＲ擴增而獲得足夠量的ＤＮＡ進行測序鑒定罪犯,。毛發(fā)、血跡,、唾沫,、精液因此都可以成為重要的罪證。利用ＰＣＲ技術(shù),，科學(xué)家們已從林肯的頭發(fā)和血液,、埃及的木乃伊、琥珀中八千萬年前的昆蟲,、恐龍的骨頭等不尋常的樣品中提取了足夠的ＤＮＡ進行研究,。博物館中的化石標(biāo)本都有可能成為遺傳學(xué)的研究對象，一門分子古生物學(xué)因此誕生,。