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近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,，基于核酸檢測的診斷方法已大量建立并廣泛應(yīng)用于人類疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測中,，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)便是其中一種，與其他的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比,，恒溫?cái)U(kuò)增有快速,、高效,、特異的優(yōu)點(diǎn)且無需專用的設(shè)備，所以它一經(jīng)出現(xiàn)就被許多學(xué)者認(rèn)為是一種有可能與PCR媲美的檢測方法,。當(dāng)前常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和核酸快速等溫檢測放大等技術(shù),。為了更好地有選擇地開發(fā)利用這方面技術(shù)，現(xiàn)就這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理,、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行簡要總結(jié),。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP )
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增其擴(kuò)增原理是基于DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí),，另一條鏈就會(huì)解離,，變成單鏈，在此前提下利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域,，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下,，以外側(cè)引物區(qū)段的3`末端末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對,，啟動(dòng)鏈置換DNA合成,。
（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10拷貝的目的基因,，擴(kuò)增效率是普通PCR的10倍-100倍（2）反應(yīng)時(shí)間短,，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備
（2）擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測序,，只能用于判斷（3）由于其敏感性強(qiáng),，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結(jié)果
依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù) (NASBA)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù),，是由1對帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù),、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù),，反應(yīng)在41℃進(jìn)行,，可以在2h左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍,，不需特殊的儀器,。
該技術(shù)一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷和病人血清中HIV-1的定量檢測。盡管RNA的擴(kuò)增也可以使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（通過反轉(zhuǎn)錄形成單鏈DNA模板),NASBA相比則有自己的優(yōu)勢：可以在相對恒溫的條件下進(jìn)行（一般恒溫為41攝氏度）,。該技術(shù)用于醫(yī)學(xué)診斷,，相對傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更為穩(wěn)定,，準(zhǔn)確。
（1）它的引物上帶有T7啟動(dòng)子序列,，而外來雙鏈DNA無T7啟動(dòng)子序列,，不可能被擴(kuò)增，因此該技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度,。（2）NASBA將反轉(zhuǎn)錄過程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中,，縮短了反應(yīng)時(shí)間。（3）對DNA病毒的檢測上NASBA就顯得不是那么適合
滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù) (RCA) 1998 年建立的滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 是模擬自然界微生物環(huán)狀 DNA 的滾環(huán)復(fù)制過程,，發(fā)展起來的一種放大信號(hào)和靶核酸相結(jié)合的檢測方法,。在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下由一條引物與環(huán)形 DNA 模板的鏈置換合成，實(shí)現(xiàn)環(huán)狀 DNA 模板的體外等溫線性擴(kuò)增,?？煞譃榫€性擴(kuò)增 (單引物 RCA)、指數(shù)擴(kuò)增,、多引物擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增RCA,。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對靶核酸的信號(hào)放大,，靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子,，因此在核酸檢測中具有很大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。
（1）高靈敏度,，RCA有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力,，線性RCA的效率可達(dá)到105倍，而指數(shù)RCA的效率可達(dá)到109倍,，具有檢測單拷貝的潛力,。（2）高序列特異性，可以區(qū)分單一位點(diǎn)的不同模式（3）擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過磷酸化處理后可直接用來測序（4）高通量,，RCA可以在靶目標(biāo)上形成閉合的環(huán)狀序列,，確保RCA產(chǎn)生的信號(hào)集中在一點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)原位擴(kuò)增和載片擴(kuò)增,。（1）瑣式探針常接近100bp,合成費(fèi)用較高,。（2）信號(hào)檢測時(shí)存在背景干擾問題
單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA) SPIA的核心是一條混合引物及可以切割DNA/RNA雜合鏈中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分組成,。在反應(yīng)過程中,，RNaseH不斷降解引物區(qū)DNA/RNA雙鏈中的RNA部分，暴露出模板上與引物RNA部分結(jié)合的位點(diǎn),，然后新引物結(jié)合上去進(jìn)行鏈置換合成,，經(jīng)過RNA降解、新引物結(jié)合,、鏈置換的循環(huán)過程,，實(shí)現(xiàn)模板互補(bǔ)序列的快速擴(kuò)增,。
依賴解旋酶 DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (HDA) 依賴解旋酶 DNA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (HDA) 是美國NEB 公司于 2004 年發(fā)明的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的自然過程,，利用解旋酶在恒溫下解開 DNA 雙鏈,，再由 DNA 單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開的單鏈為引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互補(bǔ)的雙鏈,，繼而不斷重復(fù)上述循環(huán)擴(kuò)增過程,，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長。
RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶,、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶,。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右,。常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火,、延伸三個(gè)步驟,，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的zui適溫度在37℃-42℃之間,，無需變性,，在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度,。此外,，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測,。 
鏈替代擴(kuò)增 (SDA) 技術(shù)是基于在靶DNA兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列,，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA打開缺口，DNA聚合酶延伸缺口3`端并替代下一條DNA鏈,。被替代下來的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)進(jìn)行,，使靶序列被高效擴(kuò)增,。SDA的基本系統(tǒng)包括一種限制性內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,、兩對引物,、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng),。
SDA的優(yōu)點(diǎn)：
（1）擴(kuò)增效率高
（2）反應(yīng)時(shí)間短,，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備
SDA的不足：
（1）SDA產(chǎn)物不均一,，在SDA循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單,、雙鏈產(chǎn)物,，用電泳法檢測時(shí)必然要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
（2）SDA產(chǎn)物不可能直接用于克隆,、測序和表達(dá)
（3）SDA產(chǎn)物的檢測手段有待提高,，目前主要的方法是熒光偏振檢測，需要用到熒光分光分光光度計(jì),，這限制了SDA在臨床的廣泛應(yīng)用,。
參考資料：資料整理自互聯(lián)網(wǎng)
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