隨著lncRNA，circRNA興起,，miRNA已經(jīng)漸漸失寵,。但是今天米粒兒依然想為大家分享一篇miRNA研究論文，該論文憑借miRNA+靶基因+明星通路的套路化研究,，依然能發(fā)表在12分的Hepatology上,，它有什么秘訣呢？（回復(fù)170831可下載,，一周有效）

第一：這篇文章選擇將miRNA和耐藥相結(jié)合,，選取臨床治療晚期肝癌的唯一獲批藥物索拉非尼為研究對象，發(fā)現(xiàn)miR-7可逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥,，證實(shí)miR-7可作為難治或者藥物抵抗的HCC潛在治療靶點(diǎn),。

第二：這發(fā)現(xiàn)了miR-7的新的靶點(diǎn)TYRO3，它是受體絡(luò)氨酸酶TAM家族成員之一,。在獲得性耐藥細(xì)胞株中高表達(dá),，TYRO3可以通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)Huh-7細(xì)胞的增殖,，遷移和轉(zhuǎn)移能力。本文首次報道TYRO3/PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)的索拉非尼獲得性耐藥的機(jī)制,。

機(jī)制圖

本文研究思路如下圖所示,，（1）通過體內(nèi)/體外表型實(shí)驗(yàn)證實(shí)主變量miRNA在HCC增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用；（2）在（1）的基礎(chǔ)上,，作者主要找尋miRNA的靶分子,，采用了RTK抗體芯片和Target Scan數(shù)據(jù)庫方法；（3）驗(yàn)證靶基因表型包括增殖和轉(zhuǎn)移,，以及下游明星通路PI3K/AKT,，NFκB 和RAF/MEK/ERK。（4）回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因介導(dǎo)下游通路,；（5）探討miRNA/TYRO3/PI3K/AKT 信號軸在索拉非尼耐藥中的作用,。

下邊我們詳細(xì)批講本文主要內(nèi)容

在HCC中,，EFGR的持續(xù)激活通過調(diào)控下游通路PI3K/AKT，PAK和Raf/MEK/ERK,，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,。由于miR-7在HCC中低表達(dá)，所以本文首先探討miR-7過表達(dá)的效應(yīng),，發(fā)現(xiàn)miR-7過表達(dá)呈現(xiàn)明顯的抗增殖,，抗侵襲和轉(zhuǎn)移表型，并且克隆形成能力降低(Fig 1a),。過表達(dá)后,，細(xì)胞毒性明顯升高（Fig 1b）。

接下來,，作者研究miR-7在原位HCC中的作用,。NSG免疫缺陷小鼠中靜脈注射miR-7或者對照組（Fig 1c）。在靜脈注射14天后分析發(fā)現(xiàn),，注射miR-7小鼠腫瘤負(fù)荷明顯降低,，AFP水平也明顯降低（Fig 1d）。這主要與腫瘤體積和體重降低有關(guān),。

綜上所述,，這些數(shù)據(jù)表明miR-7是HCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移主要的抑制因素,。

結(jié)果1

考慮到miR-7在HCC的重要作用,，作者下一步主要任務(wù)是尋找miR-7的新靶點(diǎn)。在這里作者用到了磷酸化受體酪氨酸激酶（RTK）抗體芯片分析,，結(jié)果顯示miR-7顯著性的降低EGFR和IGF1R的磷酸化水平（Fig 2a,， #2和#5）,。

此外，miR-7還可降低FGFR4和TYRO3的磷酸化水平（Fig 2a,，#3和#6）,。并且Target Scan分析揭示FGFR4和TYRO3都包含miR-7的種子序列。但是在之前的研究中已經(jīng)證明FGFR4可作為HCC治療的潛在靶點(diǎn),，且相應(yīng)的小分子抑制劑也已被研究開發(fā),。所以作者并沒有將其選為本文研究靶點(diǎn)。

相反的TYRO3在HCC中研究剛剛興起且前期研究表明在慢性白血病和卵巢癌中,，它的表達(dá)與化療和靶向治療的耐藥性相關(guān),。因此在作者推測TYRO3異常表達(dá)可能是HCC中SR形成的關(guān)鍵因素。

到目前為止,，由于種種限制,，TYRO3特異性的分子抑制劑還未研發(fā)，但是如果采用miR-7直接靶向TYRO3可能成為抑制TYRO3特異性表達(dá)的重要手段,。

結(jié)果2

當(dāng)miR-7在Hub-7或者HEP3B細(xì)胞中過表達(dá)后,，發(fā)現(xiàn)TYRO3的mRNA 和蛋白表達(dá)水平都顯著性降低（Fig 2b）。進(jìn)一步的,，作者采用熒光報告基因?qū)嶒?yàn)證明TYRO3是miR-7的靶基因,。瞬時轉(zhuǎn)染miR-7后可減低TYRO3的熒光活性（Fig 2c）。

臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)TYRO3在癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織（Fig 2d）,。并且TYRO3表達(dá)較高的HCC患者預(yù)后更差（Fig 2e）,。

為了研究TYRO3在HCC中的作用,，作者建立2個siRNA在Huh-7和HEP3B細(xì)胞中,，敲減TYRO3。結(jié)果顯示,，敲減TYRO3后,，細(xì)胞增殖和遷移能力下降（Fig 3a，b,，c）,。

既然TYRO3可調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移能力,，那么它的下游通路是什么呢,？作者分析了不同的下游信號分子。

首先是PI3K/AKT通路,，在TYRO3缺失的Huh-7細(xì)胞中,，AKT磷酸化水平明顯下降，而PTEN表達(dá)水平不變（Fig 3d）,。

其次,，NFκB 和RAF/MEK/ERK通路,，Rel A和ERK1/2磷酸化水平升高（Fig 3d）。以上結(jié)果表明經(jīng)典PI3K/AKT通路轉(zhuǎn)導(dǎo)TYRO3促腫瘤形成信號,。

而且,，在TYRO3表達(dá)減低的細(xì)胞中，替代通路RelA/NFκB可以被激活,。

結(jié)果3

為了理解miR-7/TYRO3信號軸在Huh-7細(xì)胞中的生物作用,，本文采用回復(fù)實(shí)驗(yàn)。首先采用anti-miR暴露48h敲減miR-7,，接著敲除TYRO3,。作者假設(shè)如果TYRO3是miR-7的直接作用位點(diǎn)，外源性敲減miR-7后TYRO3會出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象,，而接下來siRNAs引入則會拮抗這種作用,。

結(jié)果顯示敲減外源性miR-7后并不影響Huh-7細(xì)胞增殖（Fig 4a）但是會顯著性促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移（Fig 4c-d）。而TYRO3缺失并不影響Huh-7細(xì)胞增殖（Fig B）但是顯著性的拮抗了由anti-miR-7引起的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移（Fig 4c-d）,。

綜上所述,，這些數(shù)據(jù)表明在HCC中miR-7和TYRO3呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系。

結(jié)果 4

TAM受體缺失與許多促炎細(xì)胞因子和趨化因子異常表達(dá)相關(guān),，而促炎因子和趨化因子與細(xì)胞增殖相關(guān),。因此，接下來作者選擇2個HCC相關(guān)的細(xì)胞因子CXCL10和IL-8/CXCL8,，而且這兩個細(xì)胞因子本身可能與miR-7靶向結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),，TYRO3缺失顯著性提高CXCL10和IL-8/CXCL8的表達(dá)（Fig 4e）,。而且過表達(dá)miR-7降低CXCL10和IL-8/CXCL8的表達(dá)?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)miR-7不僅僅調(diào)節(jié)TYRO3表達(dá)同時也改變主要促炎細(xì)胞因子的表達(dá),。

這一特性說明miR-7在HCC中具有廣泛的生物效應(yīng)且具有作為HCC細(xì)胞增殖抑制因子的能力。

為了研究索拉非尼獲得性耐藥機(jī)制,，作者首先建立了兩個耐藥細(xì)胞系Huh-7/SR1,，Huh-7/SR2（Fig 5a）。MiR-7在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)顯著降低,，而TYRO3的mRNA表達(dá)顯著性升高（Fig 5b）,。

同時作者還發(fā)現(xiàn)在獲得性耐藥細(xì)胞株中，EGFR通路蛋白表達(dá)下降,。TYRO3蛋白水平也升高,，且pRelA表達(dá)也升高（Fig 5c）。pAKT和 pERK1/2 在兩株耐藥細(xì)胞株中表達(dá)剛好相反（Fig 5c）,。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),，這種差異效應(yīng)可能和前體細(xì)胞差異有關(guān),。與母細(xì)胞相比，Huh7/SR1細(xì)胞增殖能力更強(qiáng),，而Huh-7/SR2細(xì)胞系增殖能力較弱（Fig 5d）,。兩株耐藥細(xì)胞株的遷移和侵襲能力更強(qiáng)（Fig 5d）。

結(jié)果 5

此外,，前期研究中發(fā)現(xiàn)TYRO3異常表達(dá)在結(jié)直腸癌中調(diào)節(jié)EMT過程,。因此在本文中作者也觀察了EMT現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)Huh-7/SR2細(xì)胞失去了上皮特性,，獲得了間質(zhì)細(xì)胞特性（Fig 5E）,。

進(jìn)一步的，TYRO3缺失在母細(xì)胞和抗性細(xì)胞中都會降低細(xì)胞增殖能力（Fig 5F）,。最后,，作者發(fā)現(xiàn)siTYRO3和索拉非尼共同處理后，顯著性增強(qiáng)索拉非尼對母細(xì)胞Huh-7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性（Fig 5F）,。

接下來,，作者主要探討miR-7對索拉非尼耐藥細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)與siTYRO3相似,，miR-7也顯著性降低Hub-7/SR1和Hub-7/SR1并且削弱其遷移和侵襲能力（Fig 6a-b）,。

miR-7在Huh-7/SR2細(xì)胞系中，增強(qiáng)E-cadherin表達(dá),，并且引起多個與生存相關(guān)分子表達(dá)降低（TYRO3, pAKT, panAKT, pERK 和total RelA）（Fig 6C）,。而在miR-7表達(dá)降低時，TYRO3的配體GAS6能夠顯著增強(qiáng)Huh-7/SR2細(xì)胞系的遷移和侵襲能力,，而在miR-7存在時這種效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)（Fig 6D）,。

進(jìn)一步的，在miR-7存在情況下,，GAS6導(dǎo)致的侵襲轉(zhuǎn)移能力現(xiàn)象消失,。最后，當(dāng)用固定濃度miR-7處理索拉非尼耐藥細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞時,，EC50明顯下降（Fig 6E-F）,。采用加和模型可發(fā)現(xiàn)miR-7和索拉非尼存在協(xié)同作用。

結(jié)果6

參考文獻(xiàn)：A miR-7/GAS6/TYRO3 axis regulates the growth and invasiveness of sorafenib-resistant cells in human hepatocellular carcinoma