【原】我被傻白甜撞了一下腰~

解螺旋 2020-08-27

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作者：Lucky King（轉(zhuǎn)載請注：解螺旋·醫(yī)生科研助手）

這次文章的題目是“細(xì)胞極性蛋白Scrib——肝癌腫瘤抑制因子”（回復(fù)170517可下載）

朕關(guān)注的公眾號,，出現(xiàn)了不少關(guān)于這篇文章的科普版簡報。好奇咯,，所以這期就深入地來看看這篇熱文的實驗與思路,，別人看熱鬧，咱要看門道,。Oncotarget影響因子5分,，不算高。但作者單位,，看著拽拽的~

Scrib是膜蛋白,，涉及維持上皮組織頂端細(xì)胞極性，已知參與其他癌癥,。在哺乳動物中,，細(xì)胞極性至少由3個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（Scrib、Crumbs & Par）組成和維持,。頂端（Crumbs & Par）和基底外側(cè)（Scrib）的結(jié)構(gòu)域互相拮抗以調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種極化過程：如頂基極性、平面細(xì)胞極性,、不對稱細(xì)胞分裂和遷移等,。當(dāng)然還有參與其他過程，不贅述,。

來,，上圖~

免疫熒光(IF)觀察人肝癌樣本中Scrib，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)良好,，主要位于肝臟非腫瘤區(qū)域的細(xì)胞膜上（Fig.1A）,，藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核,，綠色熒光為Scrib；

While,，人類肝臟腫瘤細(xì)胞（HCC）樣本中Scrib高度無組織性,、沒有明確定位（Fig.1B），Scrib被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,，似乎也存在于細(xì)胞核中,；

綠色熒光非常強(qiáng)烈，DAPI相對弱,，圖像合并后幾乎觀察不到藍(lán)色,，紅色箭頭指向一些DAPI染色的細(xì)胞核（Fig.1C）；

免疫組織化學(xué)法（IHC）進(jìn)一步確定肝癌和非腫瘤肝臟之間的Scrib表達(dá)水平和定位,，與非腫瘤區(qū)域（NT）相比,，腫瘤區(qū)域（T）中檢測到更多的Scrib染色（Fig.1D）；

IHC染色還顯示了人肝臟腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)和核腔中Scrib表達(dá)(Fig.1E-H),；

臨床樣本后,，進(jìn)行動物實驗。使用二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)C57BL/6J野生型雄性小鼠中肝腫瘤,，并進(jìn)行Scrib的IF和IHC染色,。

與人類樣本類似，正常肝細(xì)胞中Scrib主要存在于膜上并且結(jié)構(gòu)良好,，而在肝臟腫瘤中Scrib定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（Fig.2A-B）,；

IHC進(jìn)一步證實，正常小鼠肝臟中,，Scrib在細(xì)胞膜表達(dá)強(qiáng)烈（Fig.2C）,；與非腫瘤區(qū)域（NT）相比，腫瘤區(qū)域（T）中檢測到更多更強(qiáng)的Scrib染色（Fig.2D）,；腫瘤細(xì)胞中,，清楚地檢測到Scrib擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（Fig.2E）；

Western印跡檢測,，與非腫瘤組織相比,，肝腫瘤中Scrib蛋白表達(dá)水平升高（Fig.2F）。

結(jié)果綜合表明：Scrib在肝腫瘤中表達(dá)增加,，并且當(dāng)肝細(xì)胞癌變時,，Scrib蛋白定位發(fā)生了改變，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)&細(xì)胞核,。

在活化增殖的肝癌細(xì)胞（HCC）中,，Scrib定位在細(xì)胞核

在正常肝臟中，90％以上的細(xì)胞是靜止的,，Scrib定位在細(xì)胞膜（Fig.1A,2A,2C）,。在肝腫瘤中,，大部分細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)，Scrib被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（Fig.1E-F,2E）,。

因此,，作者猜想：當(dāng)細(xì)胞處于主動增殖狀態(tài)時，Scrib會發(fā)生定位改變,，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,。

培養(yǎng)HCC細(xì)胞系（Hepa1-6，HepG2和Huh-7）,，通過IF和Western印跡進(jìn)行驗證,。

WB顯示：HCC細(xì)胞系（Hepa1-6、HepG2,、Huh-7）和腎上皮細(xì)胞系HEK293強(qiáng)烈表達(dá)Scrib,，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中Scrib表達(dá)相對較低（Fig.3A）；

免疫熒光(IF)染色,，在HepG2,，Huh-7和Hepa1-6細(xì)胞中，Scrib存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（Fig.3B-D）,；

從培養(yǎng)的Huh-7和Hepa1-6細(xì)胞提取細(xì)胞膜,、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，在3組成分中都檢測到了Scrib（Fig.3E-F）,，表明：在活躍的增殖細(xì)胞中,，Scrib不僅轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，而且也轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,。

為了評估Scrib易位主要發(fā)生在細(xì)胞周期中的S期還是G2/M期,，分別使用nocadazole和hydroxyurea阻斷G2/M和G1/S周期（Fig.4A-B），流式細(xì)胞儀證明周期停滯,；

使用nocadazole和hydroxyurea處理24小時后提蛋白做WB,，Hepa1-6和Huh-7表現(xiàn)出一致結(jié)果，細(xì)胞核中的Scrib表達(dá)水平高于細(xì)胞質(zhì)和膜(Fig.4C-D),，表明Scrib的定位與特定的細(xì)胞周期無關(guān),。

接著，功能試驗,，超表達(dá)或者缺失~

Scrib過表達(dá)（Scrib-OE）抑制HCC細(xì)胞體外生長,，抑制異種移植瘤生長

Hepa1-6和Huh-7中過表達(dá)Scrib（Fig.5A-B）；

Scrib過表達(dá)后,，細(xì)胞增殖顯著減少（Fig.5C-D）,；

集落形成試驗,，表明Scrib過表達(dá)會損害集落形成(Fig.5E-H),；

表明Scrib的表達(dá)增加具有抑制HCC細(xì)胞生長對的作用,。

為了進(jìn)一步確定Scrib-OE對HCC細(xì)胞生長的影響，對無胸腺裸鼠進(jìn)行皮下異種移植,。

Scrib超表達(dá)組,，異種移植腫瘤生長顯著降低（Fig.5I-K）；

這些結(jié)果表明：當(dāng)Scrib表達(dá)增加時,，具有生長抑制作用,；Scrib在HCC細(xì)胞中起著抑制腫瘤作用。

超表達(dá)完,，就是缺失/敲除,。。,。,。。

肝臟特異性Scrib缺陷型小鼠經(jīng)DEN誘導(dǎo),，肝腫瘤發(fā)生增強(qiáng)

小鼠模型,，特異性地刪除Scrib（Fig.6A）；小鼠敲除Scrib后沒有任何自發(fā)性的發(fā)育不良,、結(jié)節(jié),、肝腫瘤。（可做模型用）

DEN化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型,，分析顯示小鼠之間肝臟腫瘤的平均數(shù)沒有顯著變化（Fig.6B-D）,；

然而，進(jìn)一步分析顯示與對照小鼠相比,，Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠的較小腫瘤（<2mm）數(shù)量減少,，較大腫瘤數(shù)量增加（> 5 mm）（Fig.6E），表明肝腫瘤生長在沒有Scrib的情況下顯著增加,。

與肝腫瘤生長增加一致,，肝臟重量和肝臟/體重比例也在Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠中顯著增加（Fig.6F-H）;

組織學(xué)分析：與正常Scrib^fl/fl對比，Scrib^fl/fl-Alb^Cre（Scrib敲除）組顯示肝臟腫瘤細(xì)胞增大核染色加深,、生長緊湊（Fig.6I）,；脂肪堆積增加（Fig.6J）；纖維化增加（Fig.6K）,；

PCNA染色顯示,，Scrib^fl/fl-Alb^Cre肝臟腫瘤增殖（Fig.6L-M），但沒有檢測到對凋亡影響（Fig.6N-O）,；

表明Scrib^fl/fl-Alb^Cre小鼠腫瘤生長增加是由于增殖而不是細(xì)胞凋亡引起的,。這些結(jié)果表明，Scrib缺乏加速了肝腫瘤的生長,，因此Scrib作為肝癌中的腫瘤抑制因子起作用,。

深入分子機(jī)制

Scrib-OE使ERK激活受損,、下調(diào)Yap1、c-Myc和 cyclinD1

轉(zhuǎn)染Scrib -OE的Huh-7和Hepa1-6細(xì)胞中,，ERK活化受損,，Yap1、c-Myc和cyclinD1下調(diào)（Fig.7A-B,，?為下調(diào)）,；

然而，其他癌基因和腫瘤抑制因子的表達(dá)或者活性狀態(tài)沒有顯著改變（Fig.7A-D）,；

那就挑有變化的往下做咯~

敲除Scrib的情況下這些基因是什么情況,？

收集對照小鼠和模型小鼠肝臟腫瘤，跑Western：與正常Scribfl/fl肝腫瘤組織對比,，Scribfl/fl- AlbCre（Scrib敲除）組增強(qiáng)YAP1,、c-Myc和cyclinD1的表達(dá)（Fig.7E）。

The data show：Scrib通過抑制ERK的激活和下調(diào)Yap1,、c-Myc和cyclinD1來抑制HCC細(xì)胞增殖和肝腫瘤生長,。

通路~

作者首先想是不是通過MAPK通路，調(diào)節(jié)ERK活性,，然鵝,，對照和Scrib-OE細(xì)胞在Raf1、b-Raf,、MEK1/2的表達(dá)上沒有任何顯著差異（Fig.8A-B）,，說明新司機(jī)Scrib沒開老路，這就更加值得去研究走了哪條新路,。

看看新司機(jī)Scrib是否直接撩ERK,，并抑制其磷酸化：免疫共沉淀（Co-IP）檢測到Hepa1-6細(xì)胞中ERK和Scrib之間存在直接相互作用（Fig.8C）；

在0.1%血清饑餓和10%血清刺激的野生型MEFs（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）細(xì)胞中分別進(jìn)行Scrib/ERK Co-IP,。10%血清刺激下Scrib表達(dá)增加（Fig.8D）,；

與0.1%血清饑餓條件相比，10%血清刺激后Scrib和ERK之間的相互作用顯著增加（Fig.8E）,；

使用MEF代替HCC細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓和刺激實驗,，因為癌細(xì)胞是相對獨立的有絲分裂原，不會因為血清饑餓而保持靜止?fàn)顟B(tài),。

研究結(jié)果表明：有絲分裂途徑激活ERK,，Scrib通過直接結(jié)合ERK來控制ERK的磷酸化。

下面要驗證是否通過ERK下調(diào)Yap1,、cMyc和cyclinD1,。

因此，使用MEK抑制劑U0126處理Hepa1-6和Huh-7細(xì)胞，檢測到降低了ERK的活化,，下調(diào)了c-Myc和cyclinD1（Fig.8F-G）,；

然而，Yap1表達(dá),、磷酸化、核定位均不受ERK抑制的影響（Fig.8F-I）,。

表明：ERK在Scrib下游起作用,，并調(diào)節(jié)c-Myc和cyclinD1；而Scrib介導(dǎo)的Yap1抑制不是通過ERK途徑,。

尋找調(diào)節(jié)Yap1的途徑

找了個已知調(diào)節(jié)Yap1的途徑——Hippo pathway,，來檢測是否走的這條道兒。需要通路中的核心蛋白MST,、LATS,、MOB1、SAV1等,。

Scrib-OE組中,，檢測到LATS1（S909）的激活態(tài)磷酸化增加，并且增加了Yap1的磷酸化,，從而引起Yap1隨后的降解（Fig.9A-B）,；

與這結(jié)果相一致的是，Scrib-OE細(xì)胞中的核Yap1 減少,；Hippo pathway途徑中的另一種核轉(zhuǎn)錄因子TAZ不受影響（Fig.9C）;

表明：Scrib主要控制HCC細(xì)胞中Yap1的磷酸化和降解,。

通過放線菌酮追蹤蛋白穩(wěn)定性測定法（cycloheximide chase protein stability assay，沒做過沒見過,，朕下去也要再查查）,，檢測Scrib+/+和Scrib-/-MEFs中Yap1蛋白穩(wěn)定性。Scrib-/-細(xì)胞中Yap1穩(wěn)定性增加,，cyclin D1的穩(wěn)定性不變（Fig.9D）,；

結(jié)果綜合表明：Scrib通過調(diào)節(jié)LATS1磷酸化來控制Yap1的穩(wěn)定性。

Scrib通過ERK和Hippo信號通路抑制Yap1,，c-Myc和cyclinD1抑制HCC細(xì)胞增殖和肝腫瘤生長,。由于Scrib調(diào)節(jié)了兩個單獨的途徑，這兩個途徑之間是否存在串?dāng)_,？

用shRNA敲除YAP1,，導(dǎo)致HCC細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1下調(diào)（Fig.9E）；

過表達(dá)YAP1后,， HCC細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1的表達(dá)增加(Fig.9F),；

表明Yap1調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1的表達(dá)。

在HCC細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc，檢測到Y(jié)ap1和cyclinD1的表達(dá)增加（Fig.9G）,；

說明Yap1和c-Myc之間存在正反饋回路,。

為了進(jìn)一步研究c-Myc是否是Scrib的最終下游靶點，對一些已知的c-Myc靶基因如Glut1,、Enolase1,、LDH的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，在Scrib-OE細(xì)胞中明顯下調(diào)（Fig.9H）,；

結(jié)果表明：MAPK/ERK和Hippo/Yap1途徑之間存在串?dāng)_,；Scrib抑制ERK，促進(jìn)Yap1降解,。

整個文章的故事路線見（Fig.I）,。