【原】科研 | 日本香川大學(xué)：MicroRNA-210-3p在乙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌中的作用

轉(zhuǎn)錄組 2021-04-20

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編譯：小北，編輯：十九、江舜堯,。

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導(dǎo)讀

肝細(xì)胞癌（HCC）是癌癥引發(fā)死亡的第三個(gè)主要疾病,，也是全球第五大常見(jiàn)的癌癥。盡管肝細(xì)胞癌的早期臨床治療已有改觀,，但是受高復(fù)發(fā)因素的影響肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后普遍較差,。在80%的亞洲人中肝細(xì)胞癌是由于乙型肝炎病毒（HBV）感染導(dǎo)致的。現(xiàn)有研究表明多種核酸類(lèi)似物通過(guò)抑制HBV-DNA復(fù)制對(duì)治療乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌有作用,，但是存活率仍然很低,。在臨床上乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝細(xì)胞癌與肝纖維化分期并不存在必然聯(lián)系，在肝纖維化分期的早期也是偶爾能夠發(fā)現(xiàn),。因此尋找新的治療靶向?qū)σ种埔倚透窝撞《荆?/span>HBV）感染的肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要,。

MicroRNAs（miRNAs）是一段僅有18到22個(gè)核苷基團(tuán)的非編碼RNAs。miRNA的異常表達(dá)已經(jīng)成為人類(lèi)多種癌癥的一個(gè)普遍特征,。與正常組織相比,，肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)特異的miRNAs的異常表達(dá)。因此作者將miRNAs的靶向檢測(cè)作為乙型肝炎病毒高危的潛在生物標(biāo)記物,，從而預(yù)防與癌癥相關(guān)的死亡,。作者收集了從2002-2013年以來(lái)進(jìn)行過(guò)肝切除術(shù)的29例患者的肝細(xì)胞癌組織樣品,。對(duì)樣品進(jìn)行RNA提取后,，進(jìn)行microRNA array，熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR,，組間比較分析（HBV相關(guān)的HCC與鄰近非癌組織,、丙型肝炎病毒（HCV）相關(guān)的HCC與鄰近非癌組織以及除HBV，HCV相關(guān)的其他HCC與鄰近非癌組織），同時(shí)將HBV陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系檢測(cè)了特定miRNAs是否與乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌存在功能上的聯(lián)系,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-210-3p僅在乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平顯著上升,，相應(yīng)的，miR-210-3p的靶基因表達(dá)水平降低,。在乙型肝炎病毒（HBV）陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌中抑制miR-210-3p能夠提高靶基因的表達(dá)水平,。此外，miR-210-3p能夠調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒（HBV）感染的Huh-7/NTCP細(xì)胞中HBx的表達(dá),。研究發(fā)現(xiàn),，miR-210-3p的表達(dá)升高能夠特異的在乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌中檢測(cè)到，且在乙型肝炎病毒（HBV）陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)包括HBx在內(nèi)的多個(gè)靶基因,。因此,，miR-210-3p有望發(fā)展成為一種新的乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌檢測(cè)的生物標(biāo)記物。

論文ID

原名：The role of microRNA-210-3p in hepatitis Bvirus-related hepatocellular carcinoma

譯名：MicroRNA-210-3p在乙型肝炎病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌中的作用

期刊：American Journal of Physiology- Gastrointestinaland Liver Physiology

影響因子：3.76

發(fā)表時(shí)間：2020年1月6日

作者：Asahiro Morishita

單位：Kagawa University, Japan

DOI：doi.org/10.1152/ajpgi.00269.2019

結(jié)果

miRNA在肝細(xì)胞癌及鄰近的非癌組織中的表達(dá)

作者選取了肝細(xì)胞癌的組織以及鄰近的非癌組織,，通過(guò)提取分離組織樣本中的miRNA共檢測(cè)了2755個(gè)miRNA的表達(dá)譜,，層次集群分析（unsupervised hierarchical clustering analysis）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織樣本能夠與鄰近的非癌組織樣本明顯分開(kāi),，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1Figure A,，Figure B）。

圖1：使用Pearson相關(guān)性對(duì)表達(dá)強(qiáng)度顯著不同的miRNA進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督的層次聚類(lèi)分析,。

組間差異分析的結(jié)果也顯示microRNA-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝細(xì)胞癌組織樣本中表達(dá)水平顯著上升,，相較于丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝細(xì)胞癌組織樣本、非HBV和HCV感染的肝細(xì)胞癌組織樣本以及鄰近的非癌組織樣本（圖2）,。為了進(jìn)一步確認(rèn)microRNA-210-3p在肝細(xì)胞癌組織樣本中的表達(dá)水平,，作者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明microRNA-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝細(xì)胞癌組織樣本中表達(dá)水平顯著上升,，相較于丙型肝炎病毒（HCV）感染的肝細(xì)胞癌組織樣本和非HBV和HCV感染的肝細(xì)胞癌組織樣本（圖3）,。

圖2：通過(guò)雙因素方差分析(1)與hbv相關(guān)的HCC和鄰近的非腫瘤組織，(2)與hcv相關(guān)的HCC和鄰近的非腫瘤組織,，(3)與hbv無(wú)關(guān),、hcv無(wú)關(guān)的HCC和鄰近的非腫瘤組織。

圖3：RT-PCR檢測(cè)hsa-miR-210-3p在hbv相關(guān),、hcv相關(guān),、非hbv、非hcv相關(guān)HCC組織及相應(yīng)的鄰近非腫瘤組織標(biāo)本中的增強(qiáng)表達(dá),。

miRNA的表達(dá)與臨床參數(shù)分析

為了進(jìn)一步將miRNA的表達(dá)與臨床分析結(jié)合,，作者分析了臨床中的多個(gè)參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),，microRNA-210-3p的表達(dá)與病毒的感染（HBV vs. HCV,，HBV vs. NBNC）以及組織分化（well differentiated [WD] vs. moderately differentiated [MD]）相關(guān),，而與患者的性別、年齡,、纖維化分期,、腫瘤分期無(wú)關(guān)，這一結(jié)果提示microRNA-210-3p可作為一個(gè)新的生物化學(xué)標(biāo)記物用于指示乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,。

表1：在HCC組織中檢測(cè)miR-210-3p表達(dá)的HCC患者的特征

乙型肝炎病毒（HBV）引起肝細(xì)胞癌中,，miR-210-3p的表達(dá)能夠抑制IGF2BP2的mRNA 表達(dá)

為了進(jìn)一步確定miR-210-3p在乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝細(xì)胞癌中是高表達(dá)，作者利用Alex細(xì)胞（乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性的細(xì)胞系）和JHH-5細(xì)胞（乙型肝炎表面抗原陰性的細(xì)胞系）檢測(cè)了miR-210-3p的表達(dá)水平及其靶基因IGF2BP2的表達(dá)水平,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-210-3p的表達(dá)在Alex細(xì)胞中顯著上升,，而IGF2BP2的表達(dá)顯著降低（圖4A）。

圖4：A: 在Alex (hbsag陽(yáng)性)細(xì)胞中,，miR-210-3p表達(dá)上調(diào),，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的IGF2BP2表達(dá)下調(diào)。B: miR-210-3p的抑制增強(qiáng)了Alex (hbs陽(yáng)性)細(xì)胞中IGF2BP2的表達(dá),。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-210-3p對(duì)下游靶基因IGF2BP2的直接作用,，作者在PLC/PRF/5細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-210-3p的抑制劑，結(jié)果表明在PLC/PRF/5細(xì)胞中抑制miR-210-3p使IGF2BP2的mRNA水平顯著升高,。

以上結(jié)果均表明由乙型肝炎病毒（HBV）感染導(dǎo)致的miR-210-3p表達(dá)可能通過(guò)抑制IGF2BP2的表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖,。

在Huh-7/NTCP細(xì)胞中miR-210-3p 能夠增強(qiáng)乙型肝炎病毒HBV的復(fù)制能力replication in cells

為了進(jìn)一步確定miR-210-3p與乙型肝炎病毒（HBV）復(fù)制之間的關(guān)系，作者構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)空載（圖5A）和miR-210-3p的Huh-7/NTCP 細(xì)胞,，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（圖5B）以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)（圖5C）對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了驗(yàn)證,。接下來(lái)進(jìn)一步在上述兩株細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了乙型肝炎病毒（HBV），實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),，乙型肝炎病毒（HBV）的mRNA表達(dá)水平在miR-210-3p穩(wěn)轉(zhuǎn)的Huh-7/NTCP 細(xì)胞中顯著升高,。

圖5：A:慢病毒載體圖的示意圖。B:與模擬轉(zhuǎn)染的Huh7/NTCP細(xì)胞相比,，miR-210穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Huh7/NTCP細(xì)胞(對(duì)照組),。C:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-210的Huh7/NTCP細(xì)胞的免疫熒光。D:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-210的Huh7/NTCP細(xì)胞后HBV 634 mRNA表達(dá),。

在Huh-7/NTCP細(xì)胞中miR-210-3p能夠促進(jìn)HBx的表達(dá)

作者進(jìn)一步驗(yàn)證了乙型肝炎病毒HBV感染的肝細(xì)胞癌中的關(guān)鍵分子HBx的表達(dá)水平,，利用上述構(gòu)建成功的穩(wěn)定表達(dá)空載和HBV的Huh-7/NTCP細(xì)胞株以及穩(wěn)定表達(dá)miR-210-3p和HBV的Huh-7/NTCP細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)miR-210-3p和HBV的Huh-7/NTCP細(xì)胞株中HBx的mRNA表達(dá)水平顯著升高（圖6A）,。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了HBx的蛋白表達(dá)水平同樣顯著升高（圖6B）,。

圖6：A: miR-210/ hbv轉(zhuǎn)染Huh7/NTCP細(xì)胞中HBx mRNA的表達(dá)。B: miR-210/ hbv轉(zhuǎn)染Huh7/NTCP 細(xì)胞中HBx和IGF2BP2蛋白的表達(dá),。

以上結(jié)果表明由乙型肝炎病毒（HBV）感染導(dǎo)致的miR-210-3p表達(dá)參與激活HBx的表達(dá),。

結(jié)論

作者現(xiàn)有的研究表明miR-210-3p是乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌中唯一表達(dá)升高的microRNA，且高表達(dá)水平的miR-210-3p能夠上調(diào)HBx的表達(dá),。因此,，miR-210-3p有望成為乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌潛在的生物標(biāo)記物，通過(guò)抑制miR-210-3p的表達(dá)能夠預(yù)防與乙型肝炎病毒（HBV）感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌,。