1. CircMTO1是怎么找出來的,？

文中作者利用環(huán)形RNA芯片分析法，在7對肝細(xì)胞癌（HCC）標(biāo)本的癌組織和癌旁組織中篩選差異表達(dá)的環(huán)形RNA,，匯總了表達(dá)增高和表達(dá)降低最明顯的環(huán)形RNA各10個,，然后在21例HCC標(biāo)本中驗證，其中有6種變化相對比較明顯,。

圖1 HCC差異表達(dá)環(huán)形RNA及驗證實驗（來自[1]）

不難看出circMTO1是變化比較明顯的一種環(huán)形RNA,，但其他的環(huán)形RNA變化也比較明顯，為什么還是選擇探索circMTO1的變化呢,？作者文章介紹了個中原委：首先,，在進(jìn)一步放大的標(biāo)本量（261例HCC標(biāo)本）中高達(dá)87.4%的標(biāo)本表現(xiàn)為低表達(dá)。其次,，在早期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn),，敲低circMTO1可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，而其他的環(huán)形RNA（包括circARID1B,、circFAM13B和circFARP2）的效果不明顯,。這些線索都暗示了circMTO1在HCC中的重要作用,，因此作者將研究目標(biāo)集中在circMTO1上就順理成章的事情了。

圖2 circMTO1在HCC病人標(biāo)本中明顯下調(diào)（來自[1]）

2. CircMTO1與HCC預(yù)后的關(guān)系

從上面的結(jié)果得知circMTO1在HCC病人中明顯低表達(dá),，那么circMTO1的表達(dá)狀態(tài)與HCC患者的預(yù)后指標(biāo)關(guān)系怎樣呢,？作者集中分析了116例有生存數(shù)據(jù)的標(biāo)本中circMTO1表達(dá)與HCC疾病預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系?；诮M織原位雜交（ISH）檢測,，結(jié)果表明circMTO1在HCC病人中明顯低表達(dá)。低表達(dá)的circMTO1對應(yīng)于較差的HCC預(yù)后,。這些數(shù)據(jù)不僅支持了芯片篩選和QPCR驗證的結(jié)果,，更凸顯了circMTO1在HCC疾病中的重要意義。

圖3 circMTO1表達(dá)與HCC病人預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系（來自[1]）

3. circMTO1競爭性結(jié)合miR-9

miRNA sponge功能模型是環(huán)形RNA報道最多的功能模型,。作者也進(jìn)行了這方面的機制研究,。基于MiRanda Program預(yù)測,，得到了99中可能競爭結(jié)合的miRNA,，作者從中挑選了已報道的與HCC密切有關(guān)的20種miRNA進(jìn)行下一步的篩選分析。為得到有力的競爭性結(jié)合miRNA證據(jù),，作者進(jìn)行了相互作用miRNA的沉淀釣取實驗：RNA in vivo precipitation (RIP),，通過收集細(xì)胞內(nèi)相互作用的miRNA樣品，再在上述的20種miRNA進(jìn)行篩選,，最終發(fā)現(xiàn)miR-9與circMTO1存在相互作用,。該實驗是基于生物素標(biāo)記的探針與circMTO1的環(huán)化位點特異性結(jié)合，釣取與circMTO1相互作用的RNA分子進(jìn)行驗證的,。

圖4 RIP實驗發(fā)現(xiàn)circMTO1與miR-9存在相互作用（來自[1]）

作者還進(jìn)一步通過熒光原位雜交實驗證明了circMTO1與miR-9存在共定位關(guān)系,。

圖5 熒光原位雜交證明circMTO1與miR-9共定位（來自[1]）

4. circMTO1與HCC的關(guān)系

為探索circMTO1和miR-9在HCC細(xì)胞中作用機制，作者首先在常見的HCC細(xì)胞中分析了circMTO1和miR-9的表達(dá)情況,。SK-Hep1細(xì)胞中circMTO1表達(dá)最低而miR-9表達(dá)最高,，QGY-7701細(xì)胞中兩種RNA表達(dá)量均適中，HepG2和 SMMC-7721細(xì)胞中circMTO1表達(dá)最高而miR-9表達(dá)最低,。因此作者選擇在HepG2和 SMMC-7721細(xì)胞中進(jìn)行circMTO1的干擾實驗,，在SK-Hep1和QGY-7701細(xì)胞中進(jìn)行circMTO1過表達(dá)實驗。作者也對所設(shè)計的circMTO1的干擾RNA特異性進(jìn)行了鑒定,，表明它們均只特異性降低circMTO1的表達(dá),，而不影響MTO1的線性RNA和另一種circMTO1剪切變體的表達(dá)量。

HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中干擾circMTO1后明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移,，抑制細(xì)胞凋亡,。而在SK-Hep1和QGY-7701細(xì)胞中過表達(dá)circMTO1抑制細(xì)胞增殖。miR-9表達(dá)量分析結(jié)果表明circMTO1并不直接影響miR-9的表達(dá),，說明circMTO1是通過競爭性結(jié)合miR-9抑制后者的致癌性作用的,。P21是miR-9的一個重要靶標(biāo)分子,，進(jìn)一步的實驗表明circMTO1通過上調(diào)p21抑制HCC細(xì)胞增殖，侵襲和增強細(xì)胞凋亡,。

圖6 circMTO1通過上調(diào)p21抑制HCC細(xì)胞增殖,，侵襲和增強細(xì)胞凋亡（來自[1]）

如果circMTO1是通過競爭性結(jié)合miR-9抑制后者對p21的抑制作用而發(fā)揮作用的，直接抑制miR-9應(yīng)該也會有相似的結(jié)果,。于是作者進(jìn)行了miR-9抑制實驗以驗證這一假設(shè),。miR-9抑制劑能明顯提高p21的表達(dá)。當(dāng)敲低miR-9之后,，再干擾circMTO1就不再影響腫瘤的增殖,，遷移和凋亡狀態(tài)。這些數(shù)據(jù)充分說明circMTO1的確是通過競爭性結(jié)合miR-9,，影響后者的功能最終對HCC腫瘤發(fā)揮作用的,。

圖7 miR-9抑制劑可上調(diào)p21并可阻斷circMTO1在腫瘤中的作用（來自[1]）

最后，作者還在腫瘤體內(nèi)模型中驗證了相關(guān)結(jié)論,。通過向HCC裸鼠模型中持續(xù)兩周注射膽固醇標(biāo)記的circMTO1干擾RNA,，大大促進(jìn)了HCC模型中血液AFP（甲胎蛋白）的水平，并促進(jìn)了腫瘤的增殖,。也促進(jìn)了p21的下游基因CDK2的表達(dá),。至此,，整篇文章的故事就圓滿結(jié)束了,。

圖8 circMTO1的腫瘤內(nèi)沉默促進(jìn)體內(nèi)HCC的生長（來自[1]）

關(guān)于本文科學(xué)意義的思考

在其他微信號里，山人注意到一些同行發(fā)表了一些觀點認(rèn)為本文的故事不過如此,，更可能是因為曹雪濤院士的影響力大才發(fā)表到這么好的雜志上的,。山人不贊成這一觀點，曹雪濤院士當(dāng)然是蜚聲海內(nèi)外的著名科學(xué)家,，但本文能發(fā)表在Hepatology雜志未必是簡單的“名人效應(yīng)”的結(jié)果,，還是有不少可圈可點之處的：

首先，本文揭示的circMTO1在HCC中表達(dá)特征非常顯著,，且與腫瘤的預(yù)后相關(guān)性很強,，具有非常重要的臨床研究和應(yīng)用價值。意義大價值高的東西更容易受到優(yōu)秀雜志的青睞,。

其次,，本文提出的分子機制證據(jù)充分，論證嚴(yán)謹(jǐn),。本文發(fā)現(xiàn)的circMTO1競爭性結(jié)合miR-9的分子機制模型經(jīng)過了反復(fù)的論證,，RIP實驗和FISH實驗非常有力的支持了circMTO1競爭性結(jié)合miR-9的結(jié)論，后續(xù)在細(xì)胞和動物模型的實驗也很好的支持了circMTO1通過競爭性結(jié)合miR-9發(fā)揮對腫瘤的影響的假設(shè),。本文所展示的實驗結(jié)果嚴(yán)謹(jǐn)而有力,，不拖泥帶水,，簡潔明了而又強有力的論證了所提出的機制模型，在已發(fā)表的miRNA Sponge功能模型的文章中也是比較難得的,。清晰有力的邏輯論證也是本文的一大亮點,，這也是高水平雜志能認(rèn)可該工作的一個重要原因。

通過本文的學(xué)習(xí),，山人也參悟到一個道理：清晰嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炚撟C,，重要的科研和應(yīng)用價值都是所開展的研究工作能否受到知名雜志青睞的非常重要的前提條件。

參考文獻(xiàn)：