生物藥市場中約40%的為單克隆抗體（mAbs），單抗因而成為驅(qū)動(dòng)生物制藥工藝經(jīng)濟(jì)增長的一類主要分子,。雖然氨基酸序列決定了蛋白的生物活性,，但大多數(shù)會(huì)受翻譯后修飾的影響。翻譯后修飾如脫酰胺,、二硫鍵形成,、末端賴氨酸處理（切除）和糖基化，后者是一種發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)復(fù)雜的翻譯后修飾,。根據(jù)作用機(jī)理,，生物藥物分子的糖型可能決定了其臨床療效，因此糖基化修飾被認(rèn)為是單抗藥物的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）,。單抗產(chǎn)品通常由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá),，往往可以發(fā)現(xiàn)糖基化修飾存在批間差異。因此,，生物藥物分子在藥學(xué)及臨床研究評(píng)價(jià)階段,，需要對(duì)這種差異性的可接受范圍進(jìn)行限定。一旦商品化生產(chǎn),，蛋白藥物成功的一個(gè)先決條件就是產(chǎn)品質(zhì)量一致性,，而糖基化的監(jiān)測與控制可確保產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

已知的,，糖基化修飾可以促進(jìn)單抗產(chǎn)品的穩(wěn)定性和可溶性,，并且可以減緩形成聚體的趨勢?？贵w糖型的異質(zhì)性是生物制藥產(chǎn)業(yè)一個(gè)明顯的挑戰(zhàn),。免疫球蛋白分子構(gòu)象不僅由其多肽序列決定，而且受糖鏈與多肽及糖鏈之間相互作用的影響,。糖型受宿主細(xì)胞酶催化機(jī)制,、高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、環(huán)境因素和所能獲得糖核苷酸影響,。多因素相互作用使得各生產(chǎn)批次糖型幾乎不可能相同,，即使同一制造商使用相同的設(shè)備和工藝過程,。

本文將概述各環(huán)境因素對(duì)單抗藥物糖型的影響，描述Fc片段糖基化的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性,，并探討各類糖基化在單抗藥物效應(yīng)子功能中所扮演的角色,。既然抗體糖基化研究會(huì)橫跨上游過程的多個(gè)領(lǐng)域，我們在本文中將關(guān)注與培養(yǎng)過程相關(guān)的糖基化,，培養(yǎng)所產(chǎn)生的糖型多樣性和它們在抗體效應(yīng)子功能中所扮演的角色,。并就該話題前景做進(jìn)一步的討論。

抗體是可溶性血清糖蛋白,，在體內(nèi)產(chǎn)生并對(duì)外源性病原體進(jìn)行免疫應(yīng)答,。在人體中，有5種類型的免疫球蛋白存在：IgM,，IgA,，IgD，IgG和IgE（圖 1）,，其中IgA和IgG根據(jù)在血清中的相對(duì)濃度又可分別分為2種和4種亞型,。目前所有獲批的重組單抗藥物都是lgG型抗體，其中IgG1型抗體在血液中占主導(dǎo)地位,。如圖 1所示,，一個(gè)IgG分子包含兩條重鏈和兩條輕鏈，他們通過共價(jià)和非共價(jià)形式聯(lián)合在一起,，形成了兩個(gè)與抗原反應(yīng)的Fab片段和一個(gè)Fc片段,。

圖1 不同類型的免疫球蛋白，IgA,、IgG,、IgD、IgE和IgM示意圖,，（---）表示各區(qū)域或單體間連接的二硫鍵,。（●）表現(xiàn)與免疫球蛋白區(qū)域相連接的糖基化結(jié)構(gòu)。

Fc片段通過活性區(qū)域與受體相結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)子功能,。人類具有多種效應(yīng)子配體,，包括FcγRs（FcγRI，F(xiàn)cγRIIa,，F(xiàn)cγRIIb，F(xiàn)cγRIIIa和FcγRIIIb）,，新生兒Fc受體（FcRn）和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的C1q補(bǔ)體,。IgG的N-糖基化位于Fc片段的CH₂區(qū)的共有序列（Asn297-X-Ser/Thr，X可以是除脯氨酸的任意氨基酸殘基）,，通過酰胺鍵與抗體共價(jià)結(jié)合,。通過晶體X衍射發(fā)現(xiàn)蛋白與糖以對(duì)等方式相互作用而影響彼此構(gòu)象,。除了Fc片段糖基化外，30%的IgG在Fab片段存在N-糖基化,，對(duì)抗體分子的功效產(chǎn)生有益,、有害或中性影響。Fc糖基化糖分子具有復(fù)雜的雙天線型核心結(jié)構(gòu),，該結(jié)構(gòu)由甘露糖（Man）和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）兩種戊糖分子組成,，不同糖型除核心結(jié)構(gòu)外還另外含有不同數(shù)目的糖分子，如巖藻糖（Fuc）,，甘露糖,，N-乙酰葡糖胺，半乳糖（Gal）,，二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）（圖 2A）,。糖鏈的長度、分叉型式和單糖序列的變化導(dǎo)致了糖基化修飾的復(fù)雜性,。另外由于各種酶的原因使得N-糖基化的五糖核心結(jié)構(gòu)分為三類：高甘露糖型,、雜合型和復(fù)雜型（圖 2B）。一些商品化單抗的不同糖型及其相對(duì)豐度詳見表 1,。

IgG通過糖基化修飾的重鏈CH₂區(qū)與Fc受體和C1q補(bǔ)體結(jié)合形成免疫復(fù)合體,，從而分別發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用（ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用。IgG的N-糖基化修飾始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中將一個(gè)脂連寡糖（LLO）轉(zhuǎn)至多肽鏈Asn297上,，然后一步步進(jìn)行反應(yīng),。由于多聚糖的多樣性導(dǎo)致了微觀異質(zhì)性（聚糖的種類）和宏觀異質(zhì)性（聚糖所在位置）。聚糖的微觀異質(zhì)性取決于個(gè)體生物的種屬,、年齡,、性別和健康情況。糖型隨著諸如癌癥,、風(fēng)濕和炎性疾病發(fā)生而變化,。蛋白藥物的糖型影響生物過程的很多方面。因此,，監(jiān)管機(jī)構(gòu)基于制造商展現(xiàn)出的確保糖基化修飾一致性的能力而發(fā)放批文,。

圖2 免疫球蛋白Asn297位糖基化修飾的聚糖分子結(jié)構(gòu)異質(zhì)性示意圖

表1 一些商品化各糖型圖示舉例，根據(jù)它們相對(duì)豐度排列（1^st>2^nd>3^rd>4^th）

糖基化水平可以促進(jìn)或消除抗體的效應(yīng)子功能,。CH₂區(qū)的N-糖基化存在不同程度的異質(zhì)性,。以下我們將簡要討論對(duì)抗體效應(yīng)子功能的影響。

巖藻糖核心寡糖是在轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體中,，通過?-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶從GDP-Fuc上轉(zhuǎn)運(yùn)來的巖藻糖殘基生物合成而來,。通過具有巖藻糖和無巖藻糖修飾的Fc片段結(jié)構(gòu)分析表明：兩者間Asp280和Asn297殘基的電子密度存在差異；Tyr296殘基的水合模式也存在差異,。Lec13突變細(xì)胞表達(dá)的無巖藻糖修飾的人IgG表現(xiàn)出：與FcγRIIIa親和力提高50倍,，ADCC作用提高100倍,。無核心巖藻糖使得FcγRIIIa受體中Asn162與Fc聚糖具有更高親和力，因而結(jié)合更強(qiáng),。而巖藻糖的空間位阻會(huì)阻礙這種相互作用,。考慮到巖藻糖殘基對(duì)ADCC作用的影響極大,，已經(jīng)研發(fā)出降低IgG（僅不足10%的重組IgG是非巖藻糖糖基化的）巖藻糖糖基化的策略,。這些策略包括構(gòu)建缺少或減少?-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系；或過表達(dá)β（1-4）-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III基因（GnTIII）,，使用糖苷酶抑制劑kifunensine,，且/或通過鋅指調(diào)節(jié)沉默巖藻糖轉(zhuǎn)移子基因。

糖修飾中糖鏈末端的半乳糖苷對(duì)抗體效應(yīng)子功能的影響相對(duì)而言所知較少,。有發(fā)現(xiàn)半乳糖苷的存在可以增強(qiáng)CDC效應(yīng),。通過糖苷酶處理去除半乳糖后發(fā)現(xiàn)會(huì)降低補(bǔ)體溶解活性。由中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞生產(chǎn)的嵌合型單抗RituximabTM,，與C1q的結(jié)合（CDC活性）據(jù)知會(huì)受到Fc糖基化修飾末端半乳糖苷的影響（2倍的差異）,。CH₂區(qū)構(gòu)象因末端半乳糖變化，從而與FcγR的結(jié)合力增強(qiáng),。研究者已經(jīng)展示了高半乳糖基化和無巖藻糖基化相對(duì)天然IgG對(duì)ADCC活性具有疊加效應(yīng)（78倍）,。半乳糖基修飾的增加使得Fc結(jié)構(gòu)中的CH₂區(qū)空間距離增加，暴露出更多的可與FcγRIIIa結(jié)合的氨基酸,。與老鼠骨髓瘤細(xì)胞相比,，CHO細(xì)胞表達(dá)的抗體半乳糖基化修飾程度低，并且據(jù)報(bào)道末端半乳糖修飾是抗體特異性的,。雖然對(duì)于半乳糖基化修飾的作用理解還處于初期,，但是生產(chǎn)中還是需要確保其受控。

血清中糖蛋白的半衰期與唾液酸化水平有關(guān),，唾液酸化糖蛋白可被肝臟中特殊受體從循環(huán)系統(tǒng)中有效清除,。然而，唾液酸修飾不影響IgG的循環(huán)半衰期,。末端通過?-2,6連接的N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）對(duì)靜脈注射的免疫球蛋白（IVIGs）的抗炎活性猶如開關(guān)一般,。據(jù)知，含末端唾液酸的比不含唾液酸的IgG對(duì)蛋白酶更敏感,。因?yàn)榕cFcγRIIIa親和力降低,，及不溶性或與細(xì)胞表面抗原結(jié)合能力可能受到影響，高唾液酸水平的突變IgGs的ADCC活性表現(xiàn)下降,。大量的Neu5Ac基團(tuán)可降低鉸鏈區(qū)的柔性,，導(dǎo)致ADCC活性和抗原結(jié)合力下降。分泌表達(dá)唾液酸酶A的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的無唾液酸糖基化修飾的抗體展現(xiàn)出很強(qiáng)的ADCC活性,。這點(diǎn)也已經(jīng)被鋅指核酸酶技術(shù)改造過的CHO-gmt5細(xì)胞系所證實(shí),，該細(xì)胞系缺失CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)子。唾液酸化對(duì)抗體既有正向亦有負(fù)向作用,，因此控制唾液酸化程度對(duì)ADCC活性和抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很關(guān)鍵,。

末端GlcNAc殘基可提高CH₂區(qū)的熱穩(wěn)定性。去除這些殘基會(huì)發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定明顯變差,，與可溶性FcγRIIb的親和力略有下降,。含末端GlcNAc的IgG顯示具有更長的血清半衰期。

表達(dá)GnTIII基因的工程細(xì)胞系將二等分GlcNAc加到雙天線結(jié)構(gòu)上,，使得抗體的目標(biāo)殺傷濃度較未改造抗體的低10-12倍,。加入二等分GlcNAc的抗體與FcγRIIIa的親和力增加，從而提高了ADCC活性,。然而,，這點(diǎn)也可認(rèn)為是由于降低了核心1,6-巖藻糖的空間位阻所致。

Fc片段糖基化異質(zhì)性相當(dāng)一部分體現(xiàn)在末端甘露糖數(shù)目,，例如：Man5GlcNAc2,、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2,Man8GlcNAc2,、Man9GlcNAc2和Glc3Man9GlcNAc2,。含高甘露糖殘基的IgG分子血清半衰期較短。有很多文獻(xiàn)證實(shí),，寡聚甘露糖類在人血漿中快速被清除,。由FUT-8突變細(xì)胞系生產(chǎn)的高甘露糖型和雜合型甘露糖基化修飾的IgG顯示出比復(fù)雜糖型修飾的IgG更高的清除速率。矛盾的是,，在鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)顯示復(fù)雜糖型和高甘露糖型修飾的單克隆抗體（mAb）分子的血清半衰期沒有顯著差異,。在另外一個(gè)研究中表明血清清除與聚糖切除有關(guān)，而與聚糖結(jié)構(gòu)無關(guān),。

在非還原端具有半乳糖殘基的mAb分子由于與C1q親和力下降,，顯示出CDC活性降低。另一方面,，這些分子與FcγRIIIa親和力升高,，顯示出ADCC活性提高。這個(gè)可能與核心結(jié)構(gòu)中沒有巖藻糖有關(guān),。在重組抗體中,，細(xì)胞系和培養(yǎng)環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致甘露糖型的差異。因此,，考慮到末端甘露糖殘基對(duì)mAb藥物的藥代動(dòng)力學(xué)的顯著影響,，其應(yīng)該被考慮作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。

mAb產(chǎn)品的糖型與其所表達(dá)培養(yǎng)的條件有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。已知的,，包括宿主細(xì)胞類型,、培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程控制參數(shù)在內(nèi)的一些因素對(duì)糖型具有顯著影響。不同培養(yǎng)條件的影響詳見圖 3,。按照質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念,，各種條件如何影響細(xì)胞生理狀態(tài)從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量需要更為深入的理解。

因?yàn)樘腔D(zhuǎn)移酶和糖苷酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中線性排列的不同,，所以不同宿主細(xì)胞系表達(dá)的mAb糖型存在差異,。上述酶在上述細(xì)胞器中的濃度與分布決定了分泌表達(dá)的mAb糖基化情況（圖 4）。mAb產(chǎn)品的生產(chǎn)主力是哺乳細(xì)胞系,，包括CHO,，幼鼠腎（BHK）細(xì)胞，人胚腎（HEK293）細(xì)胞,，人胚成視網(wǎng)膜（PER.C6）細(xì)胞和白血?。∟MF-9）細(xì)胞系。其他用來生產(chǎn)生物藥的細(xì)胞系有如NS0,，SP2/0和Y0,。尤其CHO細(xì)胞系通常被用作生產(chǎn)，因?yàn)樗梢院芎玫纳L,，所得抗體糖型穩(wěn)定且與人細(xì)胞的相似,。CHO細(xì)胞系與人細(xì)胞就唾液酸與半乳糖的連接方式存在差異，CHO細(xì)胞缺少?-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶,，僅產(chǎn)生?-2,3連接的唾液酸苷,；而人細(xì)胞同時(shí)存在?-2,3&?-2,6連接的唾液酸苷且更傾向于后種連接方式。缺少?-2,6連接的唾液酸影響mAb分子的循環(huán)生命周期,。另外一個(gè)顯著差異是缺少GnTIII功能酶,，從而無法產(chǎn)生二等分GlcNAc殘基的。NS0細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生?-1,3半乳糖表位和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）而非（Neu5Ac）這樣微觀異質(zhì)性,。這會(huì)增加使用這類藥劑病人的免疫原性,。因而表達(dá)mAb的宿主細(xì)胞的選擇對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響明顯。對(duì)13個(gè)不同種屬來源的糖型回顧性研究分析顯示,，末端半乳糖,，二等分GlcNAc和巖藻糖有變化。甚至不同細(xì)胞系的不同克隆間的糖型也有不同,，寡聚甘露糖5結(jié)構(gòu)的變化改變效應(yīng)子功能的同時(shí)加速了抗體的清除速率,。相同的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)方式由分批式變?yōu)榱骷邮教切桶l(fā)生了變化,。然而,，培養(yǎng)規(guī)模從400L擴(kuò)大至5000L時(shí)糖型仍保持一致,。由此得出結(jié)論：生物反應(yīng)器的類型和培養(yǎng)模式很大程度上影響了終產(chǎn)品質(zhì)量。

圖3 哺乳細(xì)胞糖基化途徑中各種酶和糖-核苷酸前體受各種培養(yǎng)參數(shù)影響的示意圖,。培養(yǎng)參數(shù)包括（1）溫度,，（2）谷氨酰胺，（3）溶氧,，（4）葡萄糖水平,，（5）氨濃度，（6）細(xì)胞系（野生型或工程改造型）,，（7）細(xì)胞活力，（8）錳離子,，（9）丁酸鈉,，（10）核苷酸糖，（11）DMSO,，和（12）pH值,。

酵母表達(dá)系統(tǒng)（釀酒酵母和畢赤酵母）作為可選擇的表達(dá)系統(tǒng)，但沒有與人類似的修飾糖型,。酵母細(xì)胞缺少許多高爾基系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移酶,，且表達(dá)的重組蛋白高甘露糖基化。為了消除這些約束,，已經(jīng)對(duì)酵母細(xì)胞（P.pastoris）的糖基化反應(yīng)路徑進(jìn)行工程改造,，引入類似人類的翻譯后修飾。據(jù)報(bào)道,，用糖工程改造過的畢赤酵母表達(dá)的人IgG產(chǎn)量達(dá)1.4g/L,，遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。然而,，應(yīng)用到抗體生物生產(chǎn)中依然存在一些主要缺陷,，包括偶然地引入異質(zhì)的O型連接聚糖和N型聚糖結(jié)構(gòu)差異。

昆蟲細(xì)胞為融合蛋白表達(dá)提供了另外一個(gè)強(qiáng)大平臺(tái),。昆蟲細(xì)胞系如草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系（SF9或SF21）和粉紋夜蛾胚胎細(xì)胞系（BTI5B1-4）,，據(jù)報(bào)道在高爾基體表面缺少轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，阻礙了核苷酸糖的轉(zhuǎn)運(yùn),，從而使得寡糖鏈形成過程不完整,。昆蟲N型聚糖通常為由巖藻糖取代通過?-1,3-和?-1,6-與最基端的GlcNAc相連的少甘露糖型或者為高甘露糖型。雖然植物細(xì)胞表達(dá)類似的酶,，植物的N型聚糖含有β-1,2-木糖和?-1,3-巖藻糖,，會(huì)引起免疫原性且在動(dòng)物研究中引起反應(yīng)。

圖4 不同表達(dá)系統(tǒng)和人類細(xì)胞中不同N-聚糖結(jié)構(gòu)示意圖

眾所周知,，抗體糖型取決于培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)濃度,，營養(yǎng)物質(zhì)中的糖分子作為糖基化所需的糖-核苷酸前體存在培養(yǎng)基中,。培養(yǎng)基中葡萄糖水平變化明顯影響聚糖異質(zhì)性，在流加模式中更為重要,，產(chǎn)品糖型的一致性是獲得臨床預(yù)期結(jié)果的保障,。已發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的提高,，CHO細(xì)胞及新近構(gòu)建的細(xì)胞系（如F2N78）所表達(dá)的抗體半乳糖和唾液酸糖基化水平會(huì)提高,。在最近發(fā)表物中，研究了葡萄糖和谷氨酰胺對(duì)細(xì)胞生長的作用,，檢測mAb產(chǎn)率和糖基化水平,，發(fā)現(xiàn)可利用的葡萄糖在決定半乳糖和唾液酸糖基化水平中扮演了一個(gè)重要角色。在流加試驗(yàn)中間隙停止葡萄糖的補(bǔ)料會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生并且預(yù)期的糖基化水平會(huì)下降,。培養(yǎng)基中葡萄糖濃度（0-25mM）時(shí),，會(huì)觀察到葡萄糖饑餓使LLO產(chǎn)生速率變慢，導(dǎo)致占位減少和非正常糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,。在低葡萄糖水平時(shí),，細(xì)胞將葡萄糖專門用來滿足能量需求而不是補(bǔ)充給糖基化前體。這樣使得糖-核苷酸庫的不平衡,，導(dǎo)致出現(xiàn)非預(yù)期的糖型,。

利用多通道技術(shù)，通過限制葡萄糖饑餓和培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間,，發(fā)現(xiàn)葡萄糖合適的操作區(qū)間濃度（2-8g/L）,。葡萄糖饑餓程度在培養(yǎng)早期對(duì)細(xì)胞影響最大。在該階段,，大多數(shù)的控制蛋白分泌和糖基化的調(diào)控蛋白處于高水平表達(dá),，流加營養(yǎng)對(duì)核苷酸前體產(chǎn)生的作用也與之前觀察一致。在一個(gè)流加培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中添加8種不同營養(yǎng)物質(zhì),，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半乳糖,，Neu5Ac和甘露糖引起糖-核苷酸前體的變化從而調(diào)整了糖型。

在無血清收獲周期中,，向培養(yǎng)基中補(bǔ)充添加氨基酸的同時(shí)添加二價(jià)陽離子如Mn²⁺（4-40μM）可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的半乳糖苷化和唾液酸化提高,。因?yàn)镸n²⁺是高爾基體中β-1,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的輔助因子。二價(jià)陽離子在分泌路徑將寡糖連接至目的物中發(fā)揮作用,，沒有它們N型連接寡糖鏈過程將會(huì)受到抑制,。高濃度Mn²⁺（16μM）存在時(shí)，將葡萄糖用其他糖替換如半乳糖,，會(huì)發(fā)現(xiàn)甘露糖型（32%）水平升高,。高濃度Mn2+存在，同時(shí)補(bǔ)充尿苷和半乳糖,，則發(fā)現(xiàn)mAb的半乳糖修飾水平增加,。在一個(gè)設(shè)計(jì)試驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)僅存在Mn²⁺無法獲得最大程度的半乳糖修飾,，核苷酸糖前體半乳糖和尿苷的協(xié)同作用是必須的。

眾所周知,，丁酸鈉可以通過將細(xì)胞周期滯留而增加特定mAb的產(chǎn)率,，然后，在培養(yǎng)基中加入丁酸鈉觀察到會(huì)降低半乳糖修飾水平并增加mAb的堿性電荷異構(gòu)體,。添加丁酸鈉也觀察到會(huì)降低mAb唾液酸修飾水平,，盡管該結(jié)果不明顯。

單糖連接至正在成長的天線寡糖鏈結(jié)構(gòu)中需要核苷酸糖作為供給者,，其效率對(duì)最終糖型影響極深,。尿苷被認(rèn)為是合成糖-核苷酸結(jié)合體的主要前體之一，因此影響產(chǎn)品質(zhì)量,。

由于安全性及監(jiān)管問題,，在細(xì)胞培養(yǎng)基中避免使用含血清成分物質(zhì)。然而,，無血清馴化費(fèi)時(shí)且會(huì)導(dǎo)致糖型多樣化，建議在過程早期對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控,。培養(yǎng)基中補(bǔ)充的氨基酸對(duì)唾液酸修飾的影響已被很好地證明,。氨基酸的消耗直接與表達(dá)的抗體所序列所含氨基酸種類相關(guān)。因此為了獲得最佳產(chǎn)品質(zhì)量,，在培養(yǎng)過程中補(bǔ)充關(guān)鍵氨基酸并進(jìn)行濃度分析是勢在必行的,。這些還引導(dǎo)出了新的詞匯如“fermentanomics”的出現(xiàn)，利用1D1HNMR技術(shù)實(shí)時(shí)或近似實(shí)時(shí)監(jiān)控補(bǔ)料成分與細(xì)胞代謝,。利用多重變量數(shù)據(jù)分析評(píng)估m(xù)Ab糖基化與過程變量及諸如氨基酸等原材料的關(guān)系,，從而對(duì)復(fù)雜糖基化過程產(chǎn)生更為深入的了解。

影響細(xì)胞生長及產(chǎn)品質(zhì)量的最為關(guān)鍵參數(shù)是培養(yǎng)溫度,。最優(yōu)的培養(yǎng)溫度可能不一定是生產(chǎn)融合蛋白的最優(yōu)溫度,。低些的培養(yǎng)溫度（從37℃降至30-35℃）發(fā)現(xiàn)可以使細(xì)胞滯留在G0/G1期，具有更高的細(xì)胞活力和更少的細(xì)胞凋亡,。在低的溫度下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc數(shù)量減少,。研究者證實(shí)mRNA水平的提高（而非生長周期的滯留）是低溫下獲得高產(chǎn)率的背后原因。最近,，通過關(guān)鍵糖分支酶的研究對(duì)低溫條件下的mAb產(chǎn)品有了更好的了解,。發(fā)現(xiàn)這些酶下調(diào)導(dǎo)致終產(chǎn)品糖鏈結(jié)構(gòu)的異常。

所有代謝過程都需要氧氣,，所以溶氧控制對(duì)優(yōu)化細(xì)胞生長很重要,。觀察到細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白/抗體糖型的隨溶氧（DO）水平變化而改變。在鼠CC9CC10細(xì)胞表達(dá)的IgGmAb1時(shí)發(fā)現(xiàn)半乳糖基化水平的差異,，低溶氧條件下半乳糖糖基化水平也低,。這個(gè)似乎是因UDP-Gal低水平所致,，因?yàn)槠咸烟欠纸馔緩綄?dǎo)致半乳糖利用率下降。另外一個(gè)解釋是早期形成的重鏈間二硫鍵對(duì)要加入正在生長的寡糖鏈的半乳糖產(chǎn)生了空間位阻,。不同型號(hào)的生物反應(yīng)器,，即使達(dá)到相似的過程控制和溶氧條件，依然會(huì)對(duì)糖型有影響,。利用雜交瘤細(xì)胞系（BCF2）進(jìn)行一室縮小規(guī)模模擬溶氧張力（DOT）波動(dòng)培養(yǎng),，研究生物培養(yǎng)環(huán)境的差異對(duì)mAb糖型影響。據(jù)報(bào)道,，10%DO水平下培養(yǎng)三天線結(jié)構(gòu)和唾液酸數(shù)量會(huì)增加,。DOT對(duì)鼠雜交瘤細(xì)胞系HFN7.1生產(chǎn)的IgG1的糖型影響極深，DOT在10%-90%空氣飽和度變化時(shí),，半乳糖和唾液酸最大變化量分別達(dá)20%和30%,。短暫的DOT變化對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)量有著顯著影響。

氨是CHO細(xì)胞代謝谷氨酰胺或天冬酰胺時(shí)釋放到培養(yǎng)基中的有毒副產(chǎn)物,。據(jù)知,，氨水平的增加會(huì)改變CHO細(xì)胞表達(dá)的IgG的糖型，因?yàn)殇@根離子會(huì)升高高爾基體的pH值并抑制與寡糖鏈相關(guān)的酶的酶活,。對(duì)mAb生產(chǎn)而言,，理想的胞內(nèi)氨濃度低于2mM，胞外濃度4-10mM,。高爾基體pH的微小上升會(huì)導(dǎo)致?-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶定位錯(cuò)誤,，維持pH近中性會(huì)改變高爾基體的形態(tài)。高pH會(huì)影響UMP的電離狀態(tài),，UMP是一種UDP-GlcAc轉(zhuǎn)運(yùn)子的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì),，從而影響UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)高爾基體。氨水平的增加同樣顯示出：高爾基體高pH時(shí),，引起半乳糖和唾液酸修飾的降低,，從而引起甘露糖修飾的增加。氨也通過補(bǔ)償胞內(nèi)核苷酸糖庫的平衡而影響抗體糖型（圖 3）,。已有推論因?yàn)镃MP-SiaT酶水平的降低,，氨水平的提高阻止了唾液酸從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體。更進(jìn)一步,，從可用文獻(xiàn)獲知pH（理想pH6.8-7.8）對(duì)糖型的顯著影響與不同表達(dá)細(xì)胞系有關(guān),，另有結(jié)果表明pH在不同細(xì)胞系中對(duì)糖型的微觀異質(zhì)性有影響。還有些研究者報(bào)道稱人細(xì)胞系中高pH會(huì)引起半乳糖修飾水平下降,，另外一些人發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞系中高pH引起IgG3的半乳糖修飾水平增加,。

滲透壓是另外一個(gè)影響mAb生產(chǎn)、細(xì)胞生長和細(xì)胞活力的關(guān)鍵過程參數(shù),。一定范圍的高滲（300-400mOsm/kg）有益,，并被用來提高重組蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá),。添加堿、葡萄糖或其他補(bǔ)料會(huì)提高滲透壓,，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量和特殊mAb產(chǎn)品,。長時(shí)間的培養(yǎng)和培養(yǎng)基的高滲透壓會(huì)產(chǎn)生高甘露糖型的抗體藥物。據(jù)報(bào)道,，鼠雜交瘤細(xì)胞系YB2/0產(chǎn)生的mAb其巖藻糖修飾水平,，在灌注和流加兩種培養(yǎng)模式中，與培養(yǎng)基滲透壓成負(fù)相關(guān),。在285mOsm/kg滲透壓時(shí)70%巖藻糖修飾,，在345mOsm/kg滲透壓時(shí)40%巖藻糖修飾。pH和滲透壓同時(shí)變化的情況下,，低pH時(shí)pH對(duì)糖型影響占主導(dǎo)地位,，高pH時(shí)糖型與滲透壓變化相關(guān)。終培養(yǎng)基滲透壓未發(fā)現(xiàn)對(duì)CHO-K1細(xì)胞系生產(chǎn)的IgG的糖型有顯著影響,。

以上討論發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程參數(shù)決定了單抗產(chǎn)品的糖型（圖 3）,。為了闡明各種營養(yǎng)物質(zhì)的協(xié)同作用，基于統(tǒng)計(jì)模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）被用來研究各細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)和原料對(duì)終產(chǎn)品糖型的影響,。這種研究在對(duì)復(fù)雜途徑產(chǎn)生機(jī)械洞察過程中扮演了一個(gè)主要角色,。糖型分析是鑒別糖型所必需的，糖型需要可控,，即便超出可控手頭依然有生物手段可以運(yùn)用。存在太多因素影響細(xì)胞動(dòng)力學(xué)從而影響糖型,，因此這些在細(xì)胞收獲階段所做的分析無法提供有關(guān)糖型復(fù)雜性的完整信息,。

表 2 培養(yǎng)基成分和過程變量對(duì)抗體糖基化的影響

因此,，對(duì)糖基化修飾實(shí)時(shí)監(jiān)控有利于在生物工藝過程中履行質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的理念。近期,，出現(xiàn)一種新型的實(shí)時(shí)糖基化修飾監(jiān)控方法,，與超高效液相色譜聯(lián)用的微順序注射系統(tǒng)（μSI-UPLC）被用來研究Mn²⁺濃度對(duì)抗體糖型的影響。自動(dòng)實(shí)時(shí)結(jié)果可以幫助縮短開發(fā)時(shí)間,，因?yàn)榉穷A(yù)期糖型批次可以較早發(fā)現(xiàn)并終止,。產(chǎn)品的可比性和生物類似性有著嚴(yán)格的監(jiān)管要求，實(shí)時(shí)過程監(jiān)控是滿足該要求的一個(gè)先決條件,。

糖型是關(guān)鍵質(zhì)量屬性,。糖的種類、所占比例變化和單抗分子類型決定了糖型變化所引起的不同影響,。在QbD范例中,，先前的CQA知識(shí)和非臨床或臨床研究研究的經(jīng)驗(yàn)對(duì)于設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)和每個(gè)CQA可接受范圍是有益的。使用合適的工具，如多變量數(shù)據(jù)分析（MVDA）可以幫助更好得理解從原料研究,、過程控制和發(fā)展研究中所得數(shù)據(jù),。就與原研藥相似度定義一個(gè)設(shè)計(jì)空間，這樣有利于設(shè)定可接受范圍,。表3根據(jù)已有知識(shí)列出了糖分子可接受的范圍,，這些已有知識(shí)包括體外方法，臨床及臨床研究（借鑒自A-Mabcase study）,。

表3 mAb糖基化修飾可接受范圍

（摘自A-Mabcase study）

在對(duì)不同批次的Rituximab和Bevacizumab檢測發(fā)現(xiàn)N-糖型種類存在差異,，因此建議在生物類似藥開發(fā)過程中有必要建立一個(gè)稍大的設(shè)計(jì)空間。Rituximab中,，發(fā)現(xiàn)N-糖型種類差異如下：末端半乳糖修飾差異近12%,，唾液酸修飾差異2.5%，巖藻糖修飾差異2.3%和海藻糖差異1.7%,。Bevacizumab類似,，末端GlcNac差異最大（13%），次之的是末端半乳糖修飾差異（8%）,。因此,，評(píng)估原研藥批間差異有益于為生物類似藥研發(fā)建立設(shè)計(jì)空間。

補(bǔ)料策略和培養(yǎng)參數(shù)對(duì)質(zhì)量有影響,，基于對(duì)影響的理解而做出的質(zhì)量預(yù)測與實(shí)際量效關(guān)系可以通過數(shù)學(xué)模型彌合,。對(duì)復(fù)雜的糖基化路徑系統(tǒng)性的理解有助于模型建立，該模型能將過程水平信息與胞內(nèi)代謝整合,，從而得出糖型結(jié)果,。有關(guān)各種酶的協(xié)同作用和動(dòng)力參數(shù)，如親和常數(shù),、解離常數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)速率等知識(shí)需要全面掌握,，這些是建立一個(gè)穩(wěn)健的預(yù)測終產(chǎn)品糖型模型所需要的。

糖基化修飾的宏觀異質(zhì)性由糖結(jié)合位點(diǎn)差異性所致,，可由計(jì)算機(jī)模型根據(jù)各種參數(shù)如mRNA在ER上的轉(zhuǎn)錄速率，糖濃度,，糖基轉(zhuǎn)移酶的活性以及蛋白折疊速率來預(yù)測糖基化位點(diǎn),。微觀異質(zhì)性依據(jù)表達(dá)水平和糖基轉(zhuǎn)移酶位置進(jìn)行計(jì)算預(yù)測。在替代理論中提出計(jì)算機(jī)模擬高爾基體作為順序反應(yīng)器或活塞式反應(yīng)器,，而蛋白在高爾基體池中保留時(shí)間是決定最終糖型的主要因素,。在這個(gè)模型將來發(fā)展中，糖基化過程的動(dòng)態(tài)變化將與哺乳細(xì)胞mAb分泌能力及高爾基體池容量相關(guān)聯(lián),。該模型中的最優(yōu)化策略已經(jīng)成功運(yùn)用于生產(chǎn)糖工程改造細(xì)胞,。該模型進(jìn)一步改造與細(xì)胞生長動(dòng)力模型相關(guān)聯(lián)，通過考慮到胞外葡萄糖和谷氨酰胺的供給對(duì)代謝途徑中核苷酸糖合成的影響,。近期,，高通量微生物培養(yǎng)和核苷酸糖分析技術(shù)可以更好地調(diào)整和確認(rèn)構(gòu)建的細(xì)胞生長模型,，用來預(yù)測時(shí)間依賴式的糖型。該工作可以指導(dǎo)理性和精確的過程優(yōu)化從而獲得所需糖型,。

藥物糖基化是一種獨(dú)特的翻譯后修飾,，它們的合成不是模式驅(qū)動(dòng)過程，因此獲得一致的糖型是個(gè)艱巨的任務(wù),。已知糖型對(duì)一系列復(fù)雜功能具有調(diào)節(jié)作用,，發(fā)明易于實(shí)時(shí)監(jiān)控糖型的策略是中肯的。除了過程分析具有了顯著進(jìn)步,，糖基化水平控制仍是個(gè)未實(shí)現(xiàn)的目標(biāo),。生物制藥工業(yè)及學(xué)術(shù)研究者們努力彌合該差距，且已經(jīng)就翻譯后修飾復(fù)雜性的理解有了很大進(jìn)步,，就各過程變量對(duì)糖型的影響以及各聚糖種類對(duì)生物藥的療效的影響有所理解,。這也明顯暗示著在生物類似藥開發(fā)中，類似藥生產(chǎn)企業(yè)無法獲得原研藥相關(guān)研發(fā)信息,。

基于生物藥CQA做出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,，有利于制造商在藥物開發(fā)早期做出英明的決策。在mAbs中,，作為質(zhì)量屬性的糖型范圍可以通過藥物的效應(yīng)子功能,，半衰期，免疫原性和藥代動(dòng)力學(xué)/藥效估計(jì),。比如,，無巖藻糖修飾會(huì)增強(qiáng)ADCC活性，而唾液酸化會(huì)影響mAb分子的抗炎性,。因此,，根據(jù)藥物的作用機(jī)理和我們對(duì)各不同聚糖種類的生物學(xué)作用的理解，生物類似藥生產(chǎn)企業(yè)可以在研發(fā)早期根據(jù)數(shù)據(jù)做出決策,。這個(gè)將會(huì)顯著降低后期臨床試驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn),，且提高我們對(duì)可比性分析的信任。

因此,，利用強(qiáng)大的分析儀器可以實(shí)時(shí)分析和監(jiān)控糖基化修飾,，比如NMR利用單個(gè)氨基酸的分辨率并結(jié)合高級(jí)統(tǒng)計(jì)工具可以對(duì)蛋白特征進(jìn)行分析。另外,，數(shù)學(xué)模型在不久的將來會(huì)是一個(gè)強(qiáng)大的工具,，可以用來預(yù)測實(shí)時(shí)糖基化水平，還可以用來根據(jù)培養(yǎng)參數(shù)原位調(diào)整正在進(jìn)行的培養(yǎng)過程,。隨著系統(tǒng)生物學(xué)在細(xì)胞培養(yǎng)成功運(yùn)用的出現(xiàn),，一些因子如動(dòng)力學(xué)參數(shù)，代謝常數(shù)和細(xì)胞活力參數(shù)可以容易被確立。生物類似藥是已存在的生物原研藥的一種寶貴的且能負(fù)擔(dān)的替代品,，強(qiáng)大的儀器和工具對(duì)生物類似藥的出現(xiàn)有著顯著作用,。

作者對(duì)來自生物技術(shù)部的生物制藥技術(shù)卓越中心（DBTCentre of Excellence for Biopharmaceutical Technology）的資金（numberBT/COE/34/SP15097/2015）支持表示感謝。另外,，申明作者于此無利益沖突,。

參考文獻(xiàn)：

Batra J, Rathore AS. Glycosylation of monoclonal antibody products: Current status and future prospects. Biotechnol Prog. 2016 Sep;32(5):1091-1102.