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糖基化是單克隆抗體和其他重組蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一,，它對抗體效應、安全性和半衰期等都有著重要的影響,，研究人員往往要根據(jù)其抗體的作用機制和具體特征,，利用不同方法以實現(xiàn)合適的糖基化譜。 在上游生產(chǎn)期間,，研究人員發(fā)現(xiàn)可以通過選擇合適的細胞系,、基因工程、優(yōu)化工藝條件（如培養(yǎng)基和添加劑）等方式來改變糖基化譜,。目前成功應用基因工程調(diào)節(jié)治療型抗體糖基化譜的方法包括：將人α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1引入CHO,、過表達半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或唾液酸轉(zhuǎn)移酶、敲除巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8,。通過優(yōu)化工藝條件,，如溶解氧（DO）、pH,、溫度等也會影響產(chǎn)品質(zhì)量：據(jù)報道,，減少培養(yǎng)基中的溶氧會降低鼠雜交瘤細胞中產(chǎn)生的IgG1的半乳糖基化。在Muthing等人的實驗中發(fā)現(xiàn)pH 7.4下觀察到半乳糖基化水平達到最高,，而pH 7.2下唾液酸化水平達到最高,。本篇文章作者主要介紹通過細胞培養(yǎng)基添加劑以調(diào)節(jié)抗體糖基化譜。 在這項研究中,，研究人員選擇了兩種工業(yè)相關(guān)細胞系CHO K1和CHO DG44,，每種細胞系可以產(chǎn)生特有的IgG1，其具有不同的唾液酸化水平,。該研究在旋轉(zhuǎn)管（Spin tube, ST. 不受控制系統(tǒng)）和ambr?15（受控制的生物反應器系統(tǒng)）中進行培養(yǎng),，通過將培養(yǎng)基添加劑補充到細胞培養(yǎng)基中，監(jiān)測IgG的糖基化譜和細胞培養(yǎng)參數(shù)（例如活細胞密度,，活力和效價）來評估不同濃度添加劑對IgG糖基化的影響,。文章中主要給出了不同添加劑對甘露糖糖基化、巖藻糖糖基化、半乳糖糖基化和唾液酸化水平影響的結(jié)果,。圖1 為不同糖型的分類圖,。 圖2A為在ST（不受控制的系統(tǒng)）和在生物反應器系統(tǒng)ambr?15（受控系統(tǒng)）中培養(yǎng)的CHO K1（mAb1）中產(chǎn)生的IgG1的糖基化譜,。圖中帶斜杠柱形圖為受控系統(tǒng),。圖2B為在ST（不受控制的系統(tǒng)）和在生物反應器系統(tǒng)ambr?15（受控系統(tǒng)）中培養(yǎng)的CHO DG44（mAb2）中產(chǎn)生的IgG1的糖基化譜,。值得強調(diào)的是CHO K1產(chǎn)生的mAb1僅含有Fc糖基化,，而mAb2顯示另外的Fab糖基化。 對于mAb1,，受控系統(tǒng)ambr?15與不受控制系統(tǒng)ST相比,，IgG平均總半乳糖糖基化增加,，第7天、第10天和第12天增加幅度為+ 8.9%、+ 10.7%和+ 11.9%,，說明了控制DO和pH能調(diào)節(jié)IgG的糖基化水平,。受控系統(tǒng)中IgG總甘露糖和GlcNAC糖基化水平比未受控系統(tǒng)低，而總巖藻糖糖基化不受培養(yǎng)條件的影響,。 相反,，培養(yǎng)模式對mAb2的巖藻糖糖基化和甘露糖糖基化幾乎沒有影響,，表明不同細胞系對IgG的糖基化譜會產(chǎn)生穩(wěn)健的影響。在受控和未受控系統(tǒng)中觀察到隨培養(yǎng)時間的延長，mAb2總唾液酸化水平減少，而半乳糖糖基化增加,。這些數(shù)據(jù)表明,，不同的細胞系,、培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)條件等均會對糖基化譜造成影響,。 通過補充不同種類能增加高甘露糖糖型的添加劑,，評估不同添加劑對CHO K1細胞系中mAb1的聚糖種類、活細胞積分（IVC）和效價的影響（圖3）,。結(jié)果表明，15uM幾夫堿（Kifunensine）添加劑對甘露糖糖基化的影響最大,，導致含高甘露糖的糖型種類增加了85.8%,，其中糖型Man9增加幅度最大（58.4%）；添加833mM塔格糖（tagatose）可使ST系統(tǒng)中含高甘露糖的糖型種類增加30.3%,，其中Man5增加明顯（24.0%）,；750μ脫氧甘露聚霉素（deoxymannojirimycin）導致含高甘露糖的糖型種類增加28.3%，Man5,、Man6,、Man7和Man8均增加；而添加甘露糖（200g/L）會增加所有高甘露糖的糖型種類,，增加幅度最大的是Man5（13.0%），其原理可能是抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的甘露糖糖苷酶活性,。所以可根據(jù)我們希望提高的具體高甘露糖糖型,，在考慮活細胞和效價的基礎(chǔ)之上選擇合適的添加劑。 巖藻糖的缺失可顯著增強ADCC效應,，通過添加特異性降低巖藻糖糖基化的化合物或通過增加非巖藻糖化高甘露糖種類,，可以降低巖藻糖基化。圖4為降低巖藻糖糖基化的化合物,。巖藻糖衍生物（2F-PerAcFuc）是眾所周知的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,，如圖所示比Reactive Red120和MPA能更有效地減少巖藻糖糖基化。研究發(fā)現(xiàn)2F-PerAcFuc以劑量依賴性的方式降低巖藻糖糖基化,，在最高測試劑量（800μM）降低幅度最大（76.1％）,。研究人員認為添加2F-PerAcFuc可能是最有效的降低巖藻糖基化的方法。 圖5為不同添加劑對CHO K1細胞系中mAb1半乳糖糖基化,、IVC和效價的影響,。對照組培養(yǎng)至第12天,，IgG總半乳糖糖基化水平約為11.5%，單半乳糖糖基化和二半乳糖糖基化的糖型分別為10.8%和0.7%,。添加胞苷（Cyt）,、巖藻糖（Fuc）和尿苷（uridine）的混合物、氯化錳（Mn）和Mn,、半乳糖（Gal）的混合物均能增加mAb1的半乳糖糖基化水平（圖5A）且不影響IVC和效價,，其結(jié)果說明培養(yǎng)基中Mn離子的濃度以及單獨添加Mn離子都不足以實現(xiàn)最大的半乳糖基化。通過添加劑組合的方式,，如添加半乳糖（120mM）,，氯化錳（48μM）和尿苷（24 mM）的混合物能實現(xiàn)最高的半乳糖基化水平（40.9%），且在該條件下活細胞積分（圖5B）和mAb1效價都得到提高（圖5C）,，其中尿苷對細胞增殖速率和細胞周期有著重要的作用,。如圖5所示，100mM氯化銨使總半乳糖糖基化降低了8.6%,，對IVC和效價也產(chǎn)生了負面影響,，較高濃度的氯化銨（200mM）會導致細胞死亡。 由于產(chǎn)生高的唾液酸化水平建立在增加半乳糖糖基化的基礎(chǔ)之上,，所以使用半乳糖（120mM）,，氯化錳（48μM）和尿苷（24 mM）的混合物（以下稱為UMG）作為對照組。在CHO DG44細胞系中進行調(diào)節(jié)抗體唾液酸化的實驗,，對于mAb2,，添加UMG不僅能增加總體半乳糖糖基化（ST第12天，17.6%）,，總唾液酸化水平也增加了19.0%,。為了區(qū)分Fab和Fc片段的糖基化結(jié)構(gòu)，用FabRICATOR?消化抗體,，分離Fab和Fc片段,，結(jié)果顯示Fc片段幾乎不存在唾液酸化（<> 通過在細胞培養(yǎng)基中補充不同的添加劑，與對照組相比mAb2的唾液酸化糖型的總相對量在-3.6%和6.9%之間浮動（圖6B）,。比較單唾液酸化和雙唾液酸化糖型的數(shù)量,，研究人員發(fā)現(xiàn)地塞米松、氫化可的松,、CuCl2,、200mM ManNAc、和ManNAc +DANA混合物可以降低單唾液酸化糖型抗體,，增加二唾液酸化糖型抗體,。圖6C為添加劑對唾液酸化的定量影響，評估每摩爾抗體中唾液酸化水平,。圖6D和6E顯示了補料分批實驗中添加劑對IVC和效價的影響,，值得強調(diào)的是,，與對照相比，糖皮質(zhì)激素氫化可的松和地塞米松導致IVC減少或不變,，而其他添加劑均導致IVC增加,。 總結(jié)：糖基化是單克隆抗體和重組蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，通過在培養(yǎng)基中補充添加劑可以調(diào)節(jié)總糖基化的水平和類型,，為了對總糖基化水平進行微小調(diào)節(jié),，還可以通過補充組合添加劑，通過改變添加劑的種類和濃度以得到目標糖基化譜,。由于該項研究僅在小規(guī)模的反應器中進行,，所以在擴大至生產(chǎn)規(guī)模前還需要對添加劑進行額外測試?？偟膩碚f,，細胞培養(yǎng)基添加劑是非常有效的糖基化調(diào)節(jié)劑，操作起來快速方便,、能縮短開發(fā)時間,，從而降低總體開發(fā)成本。 參考文獻：Janike Ehret. Martina Zimmermann. et al. Impact of cell culture media additives on IgG glycosylation produced in CHO cells. doi: 10.1002/bit.26904. |
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