超聲聯(lián)合血清miR-21檢測對原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值

陳小紅1,，王以浪2*,，張亮2，印滇2,，高勇1,，張忠新1

（南通市第一人民醫(yī)院1超聲科；2腫瘤科,，江蘇 226001）

［摘要］目的：探討超聲聯(lián)合血清miR-21檢測對原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma,，PHC）的診斷價(jià)值。方法：對62例PHC患者進(jìn)行肝臟超聲常規(guī)檢查,，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法檢測血清miR-21水平,，以62例正常人為對照。結(jié)果：PHC患者血清miR-21表達(dá)水平是正常對照人群13.7倍,，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）,。病灶直徑≥5cm的PHC患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于病灶直徑＜5cm的HCC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）,。miR-21診斷PHC的受試者工作特征曲線下面積（ROC-AUC）為0.916±0.026,，約登指數(shù)為0.758，診斷臨界值為6.26倍,。超聲診斷PHC敏感性,、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為80.6%,、87.1%,、86.2%和81.8%，血清miR-21分別為91.9%,、83.9%,、85.1%和91.2%。兩者聯(lián)合診斷PHC的敏感性為95.2%,，陰性預(yù)測值為94.1%,，均高于超聲檢查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,。結(jié)論：超聲聯(lián)合血清miR-21檢測可以提高PHC診斷的敏感性,，降低誤診率。

［關(guān)鍵詞］原發(fā)性肝癌,；超聲,；miRNA-21；血清

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma,，PHC）是最常見的惡性腫瘤之一,，其死亡率在我國惡性腫瘤中排第二位［1-2］。PHC發(fā)病隱匿，進(jìn)展快,，臨床診斷時(shí)常為中晚期,，因此早期診斷顯得尤為重要。超聲是臨床上最常用的PHC診斷手段,，但因其圖像分辨率較低,，敏感性及特異性容易受眾多因素限制，影響診斷結(jié)果［3］,。AFP是目前臨床應(yīng)用最廣泛的PHC血清診斷標(biāo)記物,，但其陽性率僅70%左右，存在一定局限性［4］,。微小RNA（microRNA,，miRNA）由20～22個核苷酸組成，是一類非編碼單鏈小RNA分子,，以堿基互補(bǔ)配對方式與靶基因堿基結(jié)合,，通過多種機(jī)制抑制mRNA翻譯，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用［5-6］,。miRNA在外周血中可穩(wěn)定存在,，易被PCR檢測，是良好的腫瘤血清標(biāo)志物［7］,。研究表明,，microRNA-21（miR-21）與PHC的發(fā)生、發(fā)展,、轉(zhuǎn)移等相關(guān)［8-10］,。我們前期研究顯示PHC患者血清miR-21表達(dá)明顯增高，術(shù)后miR-21表達(dá)下調(diào)［11-12］,。本文用超聲對PHC患者和正常人群行常規(guī)肝臟檢查,，并用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法檢測血清miR-21水平，分析超聲聯(lián)合血清miR-21檢測對PHC的診斷價(jià)值,。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院2013年1月—2015年12月診治的PHC患者62例,，其中男性49例，女性13例,；年齡35～68歲,，平均（51.3±6.2）歲。經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實(shí),，符合2009年《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識》［13］診斷標(biāo)準(zhǔn),。另選我院門診健康體檢者62例，男性46例,，女性16例,，年齡35～68歲，平均（50.5±5.6）歲,。

1.2 超聲檢查方法應(yīng)用飛利浦iU22超聲儀,，頻率3.5～5.0MHz?；颊呖崭?0小時(shí)以上,，取平臥位與側(cè)臥位，掃查肝臟右肋下切面,，劍突下切面和右肋間切面,，觀察腫塊數(shù)目、位置,、形態(tài),、大小及內(nèi)部回聲等情況。測量PHC患者肝臟病灶最大直徑,，多病灶取最大病灶,。

1.3 血清miR-21熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR定量檢測抽取患者和正常對照者靜脈血約5mL，離心,，取血清,。抽提總RNA（Molecular Research Centre公司，美國）,，合成第一鏈cDNA（Fermentas公司,，以色列），qRT-PCR引物（miR-21和miR-16）（上海英駿生物公司）,。miR-21 PCR引物序列：miR-21反轉(zhuǎn)錄引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3′,，正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′,；miR-16正向引物：5′-CTTTGAGATTGTAGCCTGTACTGA-3,，反向引物：5′-GCCAGCTGACTGCAACACCACTA-3′。采用EzO micsTM一步熒光定量PCR法檢測患者血清miRNA表達(dá),。qRT-PCR體系：50 ng RNA,，qRT-PCR混合物12.5μL，miRNA-21反轉(zhuǎn)錄引物0.5μL,。取miRNA-21正,、反向引物各0.5μL（10μmol/L），再加ddH2O至25μL,。每份標(biāo)本檢測3次,，取平均值。以miR-16作為內(nèi)參,，miR-21表達(dá)相對定量采用2-ΔΔCt計(jì)算,。ΔCt=（Ct miR-21-Ct miR-16），ΔΔCt=［（Ct miR-21 -Ct miR-16）PHC患者-（Ct miR-21-Ct miR-16）正常人］，2-ΔΔCt數(shù)值表示PHC患者血清miR-21表達(dá)水平相對于正常人的倍數(shù),。qRT-PCR儀,、凝膠成像分析儀（BIO-RAD公司，美國）,。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，差異性比較行t檢驗(yàn),，兩樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn),，以受試者工作特征曲線下面積（ROC-AUC）評估m(xù)iR-21對PHC的診斷價(jià)值。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。

2 結(jié)果

2.1 PHC病灶超聲二維特征PHC患者塊狀型病灶41例（66.1%）,，超聲表現(xiàn)為腫塊邊緣清，形態(tài)一般規(guī)則,，周邊可有聲暈,，部分病例表現(xiàn)為主病灶外伴有播散子病灶。結(jié)節(jié)型病灶12例（19.4%）,，以單發(fā)多見,，病灶表現(xiàn)為低回聲、高回聲或者混合回聲,，周邊未見明顯聲暈,。彌漫型病灶9例（14.5%），病灶多為大小不等的高回聲,，彌漫分布于肝臟,，部分門靜脈見癌栓。

2.2 血清miR-21定量PCR檢測結(jié)果PHC患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于正常對照人群,，是后者13.7倍,，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.725，P＜0.001）,。見表1,。

表1 PHC患者和正常對照人群血清miR-21水平比較

2.3 PHC患者血清miR-21表達(dá)水平與腫瘤大小關(guān)系病灶直徑≥5cm的PHC患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于病灶直徑＜5cm的HCC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.189,，P＜0.001）,。見表2。

表2 miR-21表達(dá)水平與腫瘤大小關(guān)系

2.4 PHC患者血清miR-21ROC曲線下面積以正常對照者血清miR-21表達(dá)水平為對照,繪制ROC曲線,，見圖1,。miR-21 ROC曲線下面積為0.916，最大約登指數(shù)為0.758,，其對應(yīng)的最佳診斷臨界值為6.26倍,。

圖1 血清miR-21診斷PHC的ROC曲線

2.5 超聲和血清miR-21檢測診斷PHC敏感性和特異性比較超聲檢查,、血清miR-21檢測及兩者聯(lián)合檢查診斷PHC的敏感性、特異性,、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表3,。其中聯(lián)合檢查診斷PHC敏感性和陰性預(yù)測值均高于超聲檢查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與miR-21檢測比較,，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,。三者診斷PHC特異性和陽性預(yù)測值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 超聲和外周血miR-21檢測診斷PHC敏感性和特異性

注：與超聲組比較,，①χ2=6.143，P=0.025,；②χ2=3.864,，P=0.048

3 討論

PHC是最常見惡性腫瘤之一，全球每年有超過70萬人死于PHC,，其中一半在我國,。PHC患者一般伴隨長期肝炎病毒感染，肝硬化,，肝臟慢性損傷,，炎癥因子異常活化,，引發(fā)眾多信號通路激活,，進(jìn)而形成PHC［14］。由于HCC患者早期癥狀隱匿,，疾病進(jìn)展快,，臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬晚期，缺乏有效的治療手段,，故對高?；颊哌M(jìn)行定期篩查，早期診斷PHC非常重要,。

超聲檢查目前是診斷PHC最常用的影像學(xué)手段之一,，具有操作簡單、無創(chuàng),、可重復(fù)性強(qiáng),、費(fèi)用低、患者易接受等優(yōu)點(diǎn),。但超聲檢查受到PHC病灶位置,、病灶回聲表現(xiàn)、患者身體條件等因素制約,。此外,，PHC患者多伴有肝硬化結(jié)節(jié),，難以與PHC病灶鑒別，從而影響診斷的敏感性和特異性,。本研究對62例PHC患者和62例正常體檢患者進(jìn)行肝臟超聲檢查,，結(jié)果顯示超聲診斷PHC敏感性和特異性分別為80.6%和87.1%，存在一定的假陰性和假陽性,。假陽性主要與血管瘤,、肝腺瘤、肝膿腫等誤診為PHC有關(guān),。假陰性可能與病灶較小,，等回聲結(jié)節(jié)，脂肪肝,，腹壁及內(nèi)臟脂肪分布較厚等致使PHC病灶顯示不清相關(guān),。近來開展的超聲造影可進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確率，但因其為有創(chuàng)檢查,，且費(fèi)用較高,，臨床應(yīng)用受到限制。

超聲檢查結(jié)合血清腫瘤標(biāo)志物檢測是提高PHC診斷準(zhǔn)確率的有效途徑,。AFP作為目前臨床上最常用的PHC血清標(biāo)記物,，具有較高的敏感度，但也存在一定的假陰性,。慢性HBV感染及生殖系腫瘤患者AFP常增高,，產(chǎn)生了一定的假陽性。研究表明miR-21是診斷結(jié)腸癌可靠的血清標(biāo)記物［15］,，在PHC,、肺癌、腸癌等諸多實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)增高,。研究顯示miR-21在PHC組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的3倍,，并且與PHC患者預(yù)后密切相關(guān)［16-17］。

本研究顯示,，血清miR-21檢測診斷PHC的ROC曲線下面積為0.916,，最大約登指數(shù)為0.758，具有較好的診斷價(jià)值,。其診斷PHC的敏感性和陰性預(yù)測值均較超聲檢查高,，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩者聯(lián)合檢測診斷PHC的敏感性和陰性預(yù)測值較超聲檢查顯著增高,，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值,。

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［中圖分類號］R735.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］B

［文章編號］1006-2440（2016）05-0465-03

［收稿日期］2016-08-18

*［通信作者］王以浪,，E-mail：[email protected]