miRNA介導(dǎo)基因沉默的基本機(jī)制

Ana Eulalio, Eric Huntzinger and Elisa Izaurralde

Cell 132, 9 – 14, January 11, 2008

    微RNA是長(zhǎng)度為22核苷的RNA,，通過與標(biāo)靶mRNA 3’非翻譯區(qū)結(jié)合,，使轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)沉默。盡管對(duì)微RNA的生物合成和功能已有較多的了解,，但在動(dòng)物細(xì)胞中miRNA使基因表達(dá)沉默的機(jī)制尚無定論,。我們?cè)诒疚挠懻搈iRNA介導(dǎo)的基因沉默的各種模型,，并闡述能消彌模型差異的假說。

    微RNA（miRNA）在發(fā)育,、細(xì)胞分化,、增殖和凋亡等許多生物學(xué)過程中起重要作用。最近的證據(jù)表明miRNA也與癌癥和代謝異常等人類疾病有關(guān),。在非脊椎動(dòng)物中至少鑒定了100個(gè)miRNA基因,，在脊椎動(dòng)物和植物中已鑒定了500 – 1000個(gè)miRNA基因。根據(jù)對(duì)miRNA標(biāo)靶的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè),，估計(jì)每個(gè)miRNA調(diào)節(jié)幾百個(gè)不同的mRNA,，因此相當(dāng)大一部分轉(zhuǎn)錄體可接受miRNA的調(diào)節(jié)。

    miRNA為了執(zhí)行調(diào)節(jié)功能,，與Argonaute家族結(jié)合形成由miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(miRISC),。在這些復(fù)合物中，miRNA指導(dǎo)Argonaute蛋白進(jìn)入完全或部分互補(bǔ)的mRNA標(biāo)靶,，使這些mRNA保持轉(zhuǎn)錄后沉默,。

    盡管我們對(duì)miRNA生物合成和功能的理解正在不斷加深，但對(duì)miRNA用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制仍無定論,。已發(fā)表的研究表明,，miRNA以4種不同的方式抑制蛋白質(zhì)表達(dá)：（1）與翻譯偶聯(lián)的蛋白質(zhì)降解；（2）翻譯延長(zhǎng)的抑制,；（3）翻譯提前終止（核糖體脫落）,；（4）翻譯起始的抑制。另外,，盡管有不完全的mRNA—miRNA堿基配對(duì),，動(dòng)物miRNA能夠誘導(dǎo)mRNA標(biāo)靶大量降解。微RNA還可以在稱為mRNA加工體或P體（不存在翻譯機(jī)制）的獨(dú)立細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn),，通過螯合mRNA使其沉默,。我們?cè)诒疚闹杏懻撨@些不同的miRNA抑制機(jī)制的證據(jù)以及這些機(jī)制的差異。

翻譯起始后的抑制機(jī)制

    早期在線蟲中的研究以及最近在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的研究提供了miRNA在翻譯起始后抑制蛋白質(zhì)合成的有利證據(jù),。盡管這些研究的細(xì)節(jié)有所不同,，但其結(jié)論都來自一個(gè)共同的觀察，即miRNA及其標(biāo)靶在蔗糖沉降梯度中與多聚核糖體結(jié)合在一起,。因?yàn)檫@些多聚核糖體對(duì)各種抑制翻譯的條件敏感,，說明它們有翻譯mRNA標(biāo)靶的活性。例如,，這些多聚核糖體與多羥基瑙醇,、嘌呤霉素或密旋霉素等翻譯抑制劑短暫保溫后，可分離成核糖體單體或核糖體亞基,。

    miRNA的標(biāo)靶明顯可被有效翻譯,，但卻檢測(cè)不到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,，人們從這種自相矛盾的觀察中提出了新生多肽鏈可能在翻譯的同時(shí)被降解的假說。然而,，這種假說是建立在負(fù)結(jié)果,，而不是建立在直接的正面證據(jù)上。例如,，假定的蛋白酶的性質(zhì)尚不清楚,。蛋白酶體參與的可能性已被排除，因?yàn)榈鞍酌阁w抑制劑無法恢復(fù)沉默的報(bào)告mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá),。

    為了研究miRNA如何使標(biāo)靶沉默,，Petersen等設(shè)計(jì)了一個(gè)含有3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)的合成的miRNA報(bào)告mRNA，其3’ UTR帶有6個(gè)與轉(zhuǎn)染siRNA（miRNA類似物）部分互補(bǔ)的相同位點(diǎn),。當(dāng)這個(gè)報(bào)告mRNA瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，它與多聚核糖體結(jié)合,，盡管siRNA抑制它的表達(dá),。但是如果翻譯起始受到抑制，這些核糖體的解離要比與對(duì)照（無抑制）mRNA結(jié)合的核糖體的解離更快,。由此產(chǎn)生了miRNA引發(fā)核糖體提前解離或核糖體脫落的假說,。

    miRNA介導(dǎo)翻譯起始后的抑制還有另外的證據(jù)：即使是通過含有一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的5’ UTR啟動(dòng)的報(bào)告mRNA的翻譯，也會(huì)發(fā)生沉默,。因?yàn)镮RES啟動(dòng)的mRNA的翻譯與與mRNA帽結(jié)構(gòu)無關(guān),，所以這些結(jié)果表明miRNA是在帽識(shí)別之后的階段抑制翻譯。

翻譯起始的抑制

    與上述研究不同,，Pillai等展示了miRNA及其標(biāo)靶在蔗糖梯度中不與多聚核糖體結(jié)合,，而是與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自由mRNP結(jié)合，這說明翻譯抑制發(fā)生在起始階段,。另外,，在上述以及在其他研究中，通過不依賴帽的機(jī)制（即通過IRES）進(jìn)行翻譯的mRNA很難再被miRNA所抑制,，這進(jìn)一步支持miRNA抑制依賴于帽的翻譯起始的論點(diǎn),。

    與miRNA在阻斷翻譯起始中起作用相吻合的是，Kiriakidou等報(bào)道了一個(gè)出人意料的觀察：Argonaute蛋白的中心結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞質(zhì)帽結(jié)構(gòu)蛋白eIF4E（真核翻譯起始因子4E）有序列相似性,，eIF4E是依賴于帽的翻譯起始所必需的,。eIF4E通過在處于兩個(gè)色氨酸之間的帽的甲基化堿基上的堆積，與mRNA的m⁷Gppp-帽結(jié)構(gòu)結(jié)合,。在與eIF4E的色氨酸相對(duì)應(yīng)的位置上,，Argonaute蛋白有可介導(dǎo)類似相互作用的苯丙氨酸。類似的發(fā)現(xiàn)還有Kiriakidou展示的人Argonaute2(AGO2)與葡聚糖凝膠珠上的m⁷GTP的結(jié)合,，甲基化帽類似物（如m⁷GpppG）可與這種結(jié)合形式競(jìng)爭(zhēng),，而非甲基化m⁷GpppG不能形成競(jìng)爭(zhēng),。這些研究人員進(jìn)一步展示了用纈氨酸置換一個(gè)或兩個(gè)AGO2苯丙氨酸可消除基因沉默活性。這些結(jié)果支持miRNA通過從帽結(jié)構(gòu)中置換eIF4E,，在帽識(shí)別步驟抑制翻譯,。

    Chendrimada等報(bào)道的證據(jù)也說明miRNA抑制一個(gè)早期翻譯步驟（在延長(zhǎng)步驟之前）。他們用人細(xì)胞展示了AGO2可與eIF6以及核糖體大亞基結(jié)合,。eIF6通過與核糖體大亞基結(jié)合,，防止大亞基過早地與核糖體小亞基連接。如果AGO2使eIF6與之結(jié)合,，核糖體的大亞基和小亞基則可能無法結(jié)合,，導(dǎo)致翻譯受到抑制。

    盡管Kiriakidou和Chendrimada都提供了miRNA在翻譯延長(zhǎng)步驟之前抑制翻譯的研究結(jié)果,，但他們提出了相互排斥的基本機(jī)制,。我們必須更全面地研究eIF6和Argonaute的帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域怎樣在mRNA沉默中起作用。特別是在沒有關(guān)于真核Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)信息的情況下,，對(duì)Kiriakidou的研究結(jié)果的另一種可能的解釋是,，苯丙氨酸的突變可通過一種不同的機(jī)制影響該蛋白質(zhì)的活性。而eIF6是核糖體60S亞基生物合成所必需的,，它的缺失可能有我們不完全了解的其他影響,。

miRNA介導(dǎo)的mRNA降解

    最初的研究曾報(bào)道動(dòng)物miRNA抑制翻譯，對(duì)標(biāo)靶mRNA的豐度沒有多大影響,。然而最近的研究報(bào)告表明動(dòng)物miRNA確實(shí)導(dǎo)致標(biāo)靶大量降解,。這方面的證據(jù)包括，在miRNA途徑受到抑制（如去除Dicer或Argonaute蛋白）的細(xì)胞中,，預(yù)期的有功能的miRNA標(biāo)靶的水平增加,。相反，如果特定miRNA異常表達(dá),，含有這些miRNA結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度就會(huì)減少,。同樣，有幾個(gè)例子說明特定miRNA的表達(dá)與含有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的減少有相關(guān)性,。例如,，在斑馬魚胚胎的配子轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)時(shí)，miR-430表達(dá)的大量增加伴隨有在3’ UTR含miRNA位點(diǎn)的母系mRNA的大量降解,。

    在動(dòng)物細(xì)胞中,，miRNA不是通過Argonaute蛋白的內(nèi)切核苷水解切割降解mRNA，而是將mRNA送到普通mRNA降解機(jī)制中（除非miRNA與標(biāo)靶完全互補(bǔ)）,。在斑馬魚胚胎,、線蟲、果蠅和人細(xì)胞中對(duì)miRNA加速其標(biāo)靶的脫腺苷化和脫帽的研究支持上述觀察,。

    miRNA介導(dǎo)的信使RNA降解需要Argonaute蛋白,、P體組分GW182,、CAF1-CCR4-NOT脫腺苷酶復(fù)合物、脫帽酶DCP2和幾種脫帽活化因子（包括DCP1, EDC3和RCK/p54）,。目前的證據(jù)表明GW182通過直接作用于Argonaute蛋白而與miRNA標(biāo)靶聚集,，從而在翻譯抑制中起作用。GW182也是通過脫腺苷化和脫帽降解的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物標(biāo)靶的標(biāo)記,。

    盡管有重要證據(jù)顯示miRNA啟動(dòng)標(biāo)靶的降解,，但仍有一個(gè)懸而未決的重要問題：標(biāo)靶降解是一個(gè)造成沉默的獨(dú)立機(jī)制還是由于影響翻譯而造成標(biāo)靶降解？某些證據(jù)表明miRNA介導(dǎo)的mRNA降解不與翻譯偶聯(lián),。在人細(xì)胞中,，可通過在miRNA標(biāo)靶的5’ UTR插入一個(gè)強(qiáng)力莖環(huán)結(jié)構(gòu)抑制標(biāo)靶的翻譯,，但這種標(biāo)靶仍然以依賴于miRNA的方式脫腺苷。同樣,，在斑馬魚胚胎和人細(xì)胞抽提物中,，盡管miRNA標(biāo)靶有可破壞翻譯的缺損的帽結(jié)構(gòu)(Appp-帽)，但它們?nèi)钥擅撓佘?。此外,，在果蠅?xì)胞和人細(xì)胞抽提物中,，在不進(jìn)行翻譯時(shí)亦可發(fā)生miRNA介導(dǎo)的mRNA降解,。

    降解的程度明顯是由mRNA標(biāo)靶而不是由miRNA決定，這是因?yàn)橄嗤牡膍iRNA可以標(biāo)靶專一性方式抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解,。Aleman等發(fā)現(xiàn)miRNA是進(jìn)行降解還是進(jìn)行翻譯抑制取決于miRNA-mRNA二聚體的結(jié)構(gòu)（即誤配的數(shù)量,、類型和位置）。Grimson等發(fā)現(xiàn)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量,、位點(diǎn)之間的距離以及在3’ UTR中的位置和RNA的環(huán)境都強(qiáng)烈影響調(diào)節(jié)的程度,，盡管在每種情況中翻譯抑制和降解的相對(duì)作用尚不清楚。因此,，miRNA是否進(jìn)行mRNA降解主要取決于miRNA結(jié)合位點(diǎn)和RNA環(huán)境的特定性質(zhì),，最可能的決定因素是miRNA與特定標(biāo)靶結(jié)合蛋白的特殊相互作用。

在P體的螯合

    Argonaute蛋白,、miRNA和miRNA標(biāo)靶共處于一個(gè)稱為P體的細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn),。P體的其他組分，如GW182,、CAF-CCR4-NOT脫腺苷酶復(fù)合物,、脫帽酶DCP2、脫帽激活因子（如DCP-1,、EDC3,、Ge-1）和RNA解旋酶RCK/p54等都參與miRNA功能,。

    Argonaute蛋白、miRNA和miRNA標(biāo)靶在P體的測(cè)定產(chǎn)生了一個(gè)miRNA標(biāo)靶在P體中螯合的模型,，即miRNA標(biāo)靶與翻譯隔絕并可能被降解,。人們對(duì)miRNA定位于P體是mRNA沉默的原因還是結(jié)果仍無定論。然而,，最近的研究證實(shí),，在缺少可探測(cè)到的微小P體的細(xì)胞中，miRNA途徑并不受影響,。因此盡管P體組分在miRNA介導(dǎo)的基因沉默中起重要作用,，但miRNA的功能并不需要這些組分聚集成為微型P體。這些結(jié)果說明基因沉默是在可溶性細(xì)胞質(zhì)部分開始的,，但是沉默機(jī)制在P體的定位并不是沉默的原因,，而是它的結(jié)果。

體外研究的結(jié)果

    miRNA對(duì)翻譯起始的抑制已在各種來源的無細(xì)胞抽提物的體外研究中得到重復(fù),，包括兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物,、果蠅胚胎抽提物以及兩種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（小鼠Krebs-2腹水和人HEK293F細(xì)胞）的抽提物。miRNA可在上述抽提物中使有m⁷Gppp帽的mRNA的翻譯沉默,，但不能使有合成的Appp帽結(jié)構(gòu)（與polyA尾無關(guān)）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯沉默,。在小鼠和人細(xì)胞抽提物中，以依賴于IRES方式啟動(dòng)翻譯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很難被miRNA調(diào)節(jié),。

    對(duì)poly(A)尾在沉默中的作用研究的很少,，在正式研究這個(gè)問題時(shí)，無多聚腺苷化的mRNA或者在體內(nèi)沉默,，或者在體內(nèi)和體外都不沉默或部分沉默,，與帽結(jié)構(gòu)無關(guān)。

    Wakiyama等觀察到了mRNA沉默確實(shí)需要帽結(jié)構(gòu)和poly(A)尾,。他們的細(xì)胞抽提物還重復(fù)了早先在斑馬魚胚胎以及在人和果蠅細(xì)胞中觀察到的miRNA介導(dǎo)的脫腺苷化,。根據(jù)這些觀察,，Wakiyama等提出miRNA啟動(dòng)脫腺苷化。在他們的模型中,，翻譯受到抑制是由于無法合成帽結(jié)構(gòu)和poly(A)尾。人們已清楚知道如果細(xì)胞質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白(PABPCI)與mRNA的poly(A)尾結(jié)合,，它可以與翻譯起始因子4G(eIF4G)相互作用,。eIF4G通過與eIF4E的相互作用與帽結(jié)構(gòu)結(jié)合。這種相互作用誘導(dǎo)mRNA形成一個(gè)閉環(huán)，可極大地增加翻譯,。沉默的mRNA不能形成閉環(huán),，因?yàn)檫@些mRNA已被脫腺苷化。

    值得注意的是,，對(duì)脫腺苷化是基因沉默的原因還是結(jié)果仍有爭(zhēng)議,。Wakiyama發(fā)現(xiàn)所有含miRNA結(jié)合位點(diǎn)的mRNA都以依賴于miRNA的方式脫腺苷化，包括由于在5’ UTR有Appp帽或IRES而不能沉默的mRNA,。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)與在斑馬魚胚胎中報(bào)道的結(jié)果一致,。脫腺苷化在環(huán)己胺存在時(shí)仍可發(fā)生，說明它不需要和翻譯同時(shí)進(jìn)行,。這些結(jié)果可看作是脫腺苷化引起翻譯抑制的證據(jù),。

    其他研究表明除了脫腺苷化，還有另外一些引起翻譯抑制的機(jī)制,。例如,，在果蠅細(xì)胞中去除脫腺苷酶復(fù)合物中的一個(gè)必要組分（NOT1），可阻止miRNA介導(dǎo)的mRNA降解,，但并不能使蛋白質(zhì)表達(dá)完全恢復(fù),，這說明報(bào)告mRNA仍在翻譯水平保持沉默。與之類似的是,，Wu等表明在人細(xì)胞中,，poly(A)尾被一個(gè)組蛋白莖—環(huán)結(jié)構(gòu)置換后的報(bào)告mRNA仍受miRNA的抑制，這說明翻譯抑制不是由脫腺苷化引起的,。

    Mathonnet等報(bào)道了一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：加入純化的起始復(fù)合物eIF4F(其中包括細(xì)胞質(zhì)帽結(jié)合蛋白eIF4E,、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A)能阻止mRNA沉默,。Kiriakidou等提出過Argonaute蛋白與eIF4E競(jìng)爭(zhēng)對(duì)帽結(jié)構(gòu)的結(jié)合,，上述觀察與他們的觀點(diǎn)完全吻合,。eIF4E的更換可阻止mRNA環(huán)化，因而增加脫腺苷化,?？偠灾M管體外研究有細(xì)節(jié)上的不同,，但都表明miRNA干擾翻譯起始的早期階段,。

為什么有如此多的反應(yīng)機(jī)制,？

    協(xié)調(diào)miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)的各種已有模型是很困難的。也許這些不同的模型反映了不同的解釋和不同的實(shí)驗(yàn)方法。另一種可能性是miRNA確實(shí)需要通過多種機(jī)制來抑制基因表達(dá),。還有一種可能性是miRNA需要通過一種共同的單一機(jī)制使基因表達(dá)沉默,，已有的各種反應(yīng)模型是這種基本機(jī)制的次級(jí)反應(yīng)。

我們是否在測(cè)定基因沉默中的關(guān)鍵因素,？

    原則上我們可以通過分析沉默的報(bào)告mRNA在蔗糖沉降梯度中的位置,，輕易地將miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制的后起始模型與起始模型加以區(qū)分。在第一種模型中,，報(bào)告mRNA應(yīng)與多聚核糖體處于蔗糖梯度的相同部分中,，而在第二中模型中，報(bào)告mRNA應(yīng)該在蔗糖梯度的自由RNP部分（即在梯度的頂部）,。不幸的是,，這些實(shí)驗(yàn)沒有給出確切的結(jié)果，因此很難對(duì)結(jié)果進(jìn)行解釋,。

    首先,，除了EDTA處理外，大多數(shù)解離多聚核糖體的條件（如嘌呤霉素,、多羥基瑙醇或密旋霉素處理）不能定量地將mRNA從多聚核糖體部分轉(zhuǎn)移到mRNP部分,，而是將其從較重的部分轉(zhuǎn)移到較輕的部分。這種轉(zhuǎn)移在某些情況中屬于實(shí)驗(yàn)的測(cè)定誤差,。第二,，miRNA的抑制作用是在2—5倍的范圍。因此,，20%到50%的報(bào)告mRNA不沉默,。報(bào)告mRNA群體的這種不均一性可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第三,，一部分受到抑制的mRNA可能會(huì)部分降解（大多數(shù)研究不能排除報(bào)告mRNA有10%—15%的降解）,。根據(jù)調(diào)節(jié)的程度，這可能代表相當(dāng)一部分沉默的mRNA,。

    由于上面提到的困難,，很明顯沉降圖并不能提供支持或否定某一機(jī)制的明確證據(jù)。出于對(duì)上述方法局限性的警惕,，許多研究使用一個(gè)獨(dú)立的方法以便得到正確的結(jié)論,。IRES的使用是這種獨(dú)立方法之一。在特定研究中,，用含有IRES的報(bào)告mRNA得到的結(jié)果與多聚核糖體沉降圖分析結(jié)果一致,，但在不同的研究中結(jié)果很不相同，說明存在實(shí)驗(yàn)偏差,。

實(shí)驗(yàn)方法的偏倚,？

    大多數(shù)翻譯起始受到抑制的證據(jù)來自對(duì)體外合成后再與無細(xì)胞抽提物一起保溫的mRNA的研究,，或來自對(duì)轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞的mRNA的研究。miRNA標(biāo)靶在體內(nèi)并不是“裸”mRNA,，而是以核糖核蛋白體或mRNP形式存在,。一般認(rèn)為RNA結(jié)合蛋白是在轉(zhuǎn)錄時(shí)或在加工期間與mRNA結(jié)合。因此與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA完全互補(bǔ)的蛋白質(zhì)可能不同于在體外系統(tǒng)或在mRNA轉(zhuǎn)染后與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì),。這也許可以解釋某些研究中觀察到的差異,，如在Humphreys等人和在Petersen等人的研究中出現(xiàn)的差異。這些研究的意義是RNA結(jié)合蛋白對(duì)miRNA的終極調(diào)節(jié)作用有很大的影響,。

    研究分歧的另一個(gè)來源是報(bào)告mRNA的性質(zhì),。某些研究使用的人工報(bào)告mRNA在非同源的3’ UTR中含有多個(gè)相同的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。為了達(dá)到有效的基因沉默,，這些人工報(bào)告mRNA需要有多達(dá)6個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),，而天然的3’ UTR很少有6個(gè)等距離的相同miRNA結(jié)合位點(diǎn)。因此人工報(bào)告mRNA可能無法完全重現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié),。另外,，在使用這類報(bào)告mRNA時(shí)，可能會(huì)觀察到不同的機(jī)制,，所以僅依據(jù)這些報(bào)告mRNA無法解釋在實(shí)驗(yàn)中觀察到的所有差異,。

    其他的實(shí)驗(yàn)差異存在于是使用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄加工的miRNA還是使用轉(zhuǎn)染的siRNA。如果報(bào)告mRNA含有部分互補(bǔ)的miRNA結(jié)合位點(diǎn),，一般認(rèn)為siRNA可進(jìn)行miRNA的反應(yīng),。然而，目前尚不清楚在人細(xì)胞中,，雙鏈miRNA或siRNA中間物的生物合成途徑或結(jié)構(gòu)怎樣影響miRNA或siRNA與哪一種Argonaute蛋白結(jié)合,。在果蠅的研究中已證實(shí)，是微小的RNA雙鏈結(jié)構(gòu)而非生物合成途徑?jīng)Q定哪一種含有Argonaute的復(fù)合物與miRNA或siRNA結(jié)合,。如果在人細(xì)胞中也是如此,，內(nèi)源miRNA和轉(zhuǎn)染的siRNA將與不同的Argonaute復(fù)合物結(jié)合。

    一共有4種人Argonaute同源蛋白,，它們可能都是通過類似的機(jī)制（盡管尚未得到深入研究）抑制翻譯,。大多數(shù)研究沒有建立哪一種Argonaute同源蛋白具有基因沉默活性。這引發(fā)了下列問題：不同的Argonaute蛋白是通過相同的還是不同的分子機(jī)制使互補(bǔ)的標(biāo)靶沉默,？由此產(chǎn)生的推論是不同研究中的差異是否反映了不同的Argonaute蛋白或具有不同蛋白組分的Argonaute復(fù)合物的不同反應(yīng),？含有mRNA—蛋白質(zhì)復(fù)合物的Argonaute的生化純化揭示了與個(gè)別Argonaute蛋白結(jié)合的mRNA確實(shí)不完全相同,，這說明存在一定程度的標(biāo)靶選擇專一性,。

多重機(jī)制還是多種輸出？

    對(duì)天然全長(zhǎng)3’ UTR進(jìn)行比較的研究指出,，miRNA調(diào)節(jié)的最終影響取決于標(biāo)靶3’ UTR的特征和序列,。在這些研究中，就每一對(duì)miRNA標(biāo)靶而言，翻譯抑制或mRNA降解對(duì)基因沉默有不同的影響,。

    應(yīng)力條件進(jìn)一步為3’ UTR周圍序列的重要性提供了證據(jù),，因?yàn)橹T如HuR類蛋白與陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(CAT-1)mRNA的3’ UTR的結(jié)合可解除miR-122介導(dǎo)的基因沉默。盡管還不清楚HuR是直接置換miR-122還是通過反式作用間接影響其功能,，但其他的RNA結(jié)合蛋白也很可能通過標(biāo)靶專一性方式阻止,、調(diào)節(jié)或影響miRNA調(diào)節(jié)的內(nèi)容和方式。RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)miRNA功能的例子正在不斷增加,。

    然而,，miRNA仍可能是通過一個(gè)共同的單一機(jī)制使表達(dá)沉默，多種反應(yīng)模式只是反映了這種基本機(jī)制的次級(jí)影響,，而并非是獨(dú)立的機(jī)制,。這些次級(jí)影響可以因細(xì)胞或標(biāo)靶的不同而發(fā)生變化。例如,，翻譯抑制可能是一個(gè)按照標(biāo)靶或細(xì)胞專一性發(fā)揮作用的基本機(jī)制,，它可以引起也可以不引起mRNA降解。與標(biāo)靶mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)確實(shí)可以影響降解,。細(xì)胞專一性也可能影響降解,。例如，在體細(xì)胞中,，斑馬魚nanos1 mRNA通過miR-430脫腺苷化和降解,，但在生殖細(xì)胞中很難進(jìn)行同樣的miR-430的調(diào)節(jié)。

    同樣,，人們可以想象與翻譯同時(shí)發(fā)生的蛋白質(zhì)降解是在翻譯延長(zhǎng)過程中發(fā)生的基本機(jī)制的作用結(jié)果,。沉默的核糖體可發(fā)出諸如新生肽鏈?zhǔn)艿浇到獾姆g異常信號(hào)。Nottrott等曾經(jīng)描述過新生肽在翻譯同時(shí)被降解的例子,。

結(jié)論

    越來越多的證據(jù)表明miRNA在人類疾病中,，如在癌癥、神經(jīng)疾病,、代謝疾病和病毒感染中起重要作用,。對(duì)miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)機(jī)制的深入理解，對(duì)評(píng)估m(xù)iRNA作為潛在治療標(biāo)靶至關(guān)重要,。盡管我們已開始理解miRNA的生物合成并鑒定了重要的miRNA功能影響因子,，但miRNA在動(dòng)物細(xì)胞中的作用模式仍有極大爭(zhēng)議。我們認(rèn)為目前所觀察到的不同的機(jī)制不太可能是由于不同的技術(shù)方法,。相反,，我們傾向于認(rèn)為以不同方式出現(xiàn)的miRNA抑制作用取決于mRNA標(biāo)靶的特征和組分。目前我們無法判斷這些不同的抑制模式是代表多個(gè)不同的沉默機(jī)制還是代表一個(gè)單一基本機(jī)制的多種作用結(jié)果,。