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m6A越來(lái)越受到大家的重視了,，也越來(lái)越多的人想要入局。根據(jù)pubmed的統(tǒng)計(jì),，2019年共發(fā)表了434篇,，2020年發(fā)表了855篇，2021年還有兩個(gè)月就已經(jīng)發(fā)表了1255篇,。你過(guò)你對(duì)m6A是什么還一無(wú)所知,，除了這篇你還可以看看《CNS熱點(diǎn),、國(guó)自然熱門(mén)，m6A的前世今生》,，如果想進(jìn)階,，那可以再看看《兩個(gè)月內(nèi)頻登高分期刊,，此熱點(diǎn)憑什么如此受追捧？》,、《這個(gè)研究熱點(diǎn)的重磅數(shù)據(jù)庫(kù)！錯(cuò)過(guò)真要悔一生》,、《蹭國(guó)自然熱點(diǎn),，發(fā)15分文章,！》
今天的這篇綜述是2019年9月美國(guó)康奈爾大學(xué)威爾醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系Samie R. Jaffrey教授在影響因子高達(dá)80分的《Nature Reviews Molecular Cell Biology》雜志上發(fā)表的,。雖然發(fā)表有兩年了，但是對(duì)于廣大的同學(xué)來(lái)說(shuō),，仍然是絕對(duì)值得認(rèn)真學(xué)習(xí),，吸取精華。為了幫助大家更好的吸收綜述的內(nèi)容,，本工在閱讀綜述的時(shí)候,，也給大家翻譯了遍（除了introduction，因?yàn)閮?nèi)容和之前的推送重復(fù)較多）,，希望能給大家?guī)?lái)有真正價(jià)值的“學(xué)術(shù)營(yíng)養(yǎng)”,。m6A是mRNA中最豐富的mRNA內(nèi)部修飾，并已成為一種廣泛的調(diào)控機(jī)制,，調(diào)控不同生理過(guò)程中的基因表達(dá),。全轉(zhuǎn)錄組的m6A圖譜揭示了m6A修飾在細(xì)胞RNA中的分布和模式，這也被稱(chēng)為表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組（表1）,。這些圖譜揭示了受m6A調(diào)控的特定mRNA,，并提供了m6A修飾與細(xì)胞分化、腫瘤進(jìn)展和其他過(guò)程之間的機(jī)制聯(lián)系,。m6A對(duì)mRNA的影響是由m6A readers和m6A writer（修飾酶）復(fù)合體成分以及潛在的erasers（去修飾酶）所介導(dǎo)的,。在本文中，我們回顧了一些新的和剛發(fā)現(xiàn)的表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組特征和定量方法,，并討論了關(guān)于我們對(duì)m6A readers,、writer和eraser的機(jī)制和功能的理解。發(fā)生m6A甲基化的mRNA的“生命周期”在轉(zhuǎn)錄期間就開(kāi)始了,。m6A的write（修飾/writing）和擦除（去修飾/erasing）主要發(fā)生在細(xì)胞核階段,，因?yàn)橛珊诵某煞諲6-腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3及其銜接蛋白（adaptors）組成的m6A writer復(fù)合體（圖1）（見(jiàn)下文），以及m6A去修飾蛋白都主要定位于細(xì)胞核,。在核階段,，m6A可以結(jié)合特定的核reader，這可能會(huì)影響mRNA的剪接或其他核過(guò)程,。在輸出到細(xì)胞質(zhì)后,，m6A與特定的細(xì)胞質(zhì)reader蛋白結(jié)合，從而影響mRNA的穩(wěn)定性,、翻譯和/或定位,。1978年所發(fā)現(xiàn)的m6A的最顯著功能是導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定。這項(xiàng)研究使用放射性同位素代謝標(biāo)記來(lái)比較含有m6A修飾的mRNA和缺少m6A修飾的mRNA的半衰期,。這為m6A的功能作用提供了首個(gè)證據(jù),。最近的研究表明，細(xì)胞質(zhì)的m6A結(jié)合蛋白YTHDF2（也稱(chēng)之為DF2）可促進(jìn)m6A的不穩(wěn)定性（圖1）,。然而,，DF2發(fā)生耗竭后也只稍微穩(wěn)定了m6A修飾的mRNA（mRNA半衰期平均增加約30%）,。這與METTL3的耗竭可形成鮮明的對(duì)比，后者可使得mRNA半衰期更顯著地增加,。因此,，m6A對(duì)mRNA穩(wěn)定性的影響不太可能僅由DF2介導(dǎo)。胞質(zhì)mRNA不會(huì)發(fā)生m6A甲基化,，因?yàn)閙6A的形成是在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄共同發(fā)生的,。因此，與蛋白質(zhì)磷酸化可以在細(xì)胞質(zhì)中以信號(hào)依賴(lài)的方式發(fā)生有所不同,，信號(hào)通路不會(huì)在細(xì)胞質(zhì)的mRNA上誘導(dǎo)m6A,，m6A也不會(huì)在信號(hào)通路的作用下誘導(dǎo)發(fā)生轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)換,。相反,，m6A是細(xì)胞核事件的一個(gè)印記，它標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄本在到達(dá)細(xì)胞質(zhì)時(shí),，其半衰期更短,。許多研究通過(guò)三種不同的機(jī)制將m6A與翻譯上調(diào)相聯(lián)系起來(lái)。第一種是典型的m6A reader YTHDF1,，也被稱(chēng)為DF1,，它被認(rèn)為會(huì)與真核翻譯啟動(dòng)因子eIF3結(jié)合，eIF3是一種多蛋白復(fù)合物,，可將其小核糖體亞單位招募到mRNA上以促進(jìn)翻譯,。由于m6A和DF1的結(jié)合點(diǎn)大多位于終止密碼子周?chē)?'UTR中，這個(gè)意味著DF1可將eIF3招募到這些區(qū)域,。鑒于eIF3通常位于A(yíng)UG起始密碼子的上游以促進(jìn)翻譯的啟動(dòng),，所以目前還不清楚eIF3招募到終止密碼子卻會(huì)如何增強(qiáng)翻譯的。m6A介導(dǎo)翻譯增強(qiáng)的另一個(gè)機(jī)制涉及5'UTR 處的m6A與eIF3發(fā)生直接結(jié)合,。只有當(dāng)m6A修飾存在于5'UTR時(shí)才會(huì)增強(qiáng)翻譯,，這也大概反映了m6A依賴(lài)性的eIF3在起始密碼子上游的定位作用。令人驚訝的是,，m6A介導(dǎo)的翻譯啟動(dòng)不需要eIF4E,，含有7-甲基鳥(niǎo)苷的mRNA cap結(jié)合蛋白可招募eIF3。因此,，m6A的存在繞過(guò)了對(duì)eIF4E的正常需求,，可能這也是eIF4E功能受損時(shí)的一種重要翻譯模式。因?yàn)橹挥猩贁?shù)mRNA在5'UTR中含有m6A,，所以這種機(jī)制只限于一小部分含有m6A的mRNA,。然而，在壓力下,，熱休克蛋白所編碼的mRNA和其他在其5'UTR區(qū)域含有m6A的轉(zhuǎn)錄本會(huì)被誘導(dǎo),，從而可能在壓力下增強(qiáng)翻譯,。另外，m6A似乎也在環(huán)狀RNA中有所富集,，m6A可能通過(guò)這一機(jī)制增強(qiáng)這些轉(zhuǎn)錄本在開(kāi)放閱讀框的翻譯,。翻譯增強(qiáng)的第三個(gè)機(jī)制涉及METTL3的直接翻譯激活。在這個(gè)模型中,，METTL3在細(xì)胞核中可甲基化mRNA,，但在輸出到細(xì)胞質(zhì)時(shí)仍與轉(zhuǎn)錄本發(fā)生結(jié)合。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),，METTL3與eIF3結(jié)合,，eIF3再與mRNA cap相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。這可以使得在mRNA 3'UTR處的METTL3和同一mRNA的5'mRNA cap之間形成mRNA環(huán)路,。這被認(rèn)為可使得處于終止密碼子處的核糖體能夠重新加載到轉(zhuǎn)錄本的5'UTR處,。但目前仍不清楚METTL3如何在沒(méi)有METTL14銜接蛋白的情況下與RNA結(jié)合，因?yàn)楹颂求w通常會(huì)在終止密碼子處發(fā)生分解,；以及這一機(jī)制又會(huì)如何調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的mRNA,，因?yàn)橥ǔETTL3在細(xì)胞質(zhì)中用標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光方法不能檢測(cè)到。核糖體的分析研究一般不支持m6A在大多數(shù)m6A所修飾的mRNA中促進(jìn)翻譯的作用,。對(duì)照組和METTL3敲除組的細(xì)胞核糖體分析數(shù)據(jù)的比較結(jié)果顯示,，除了在5'UTR中有m6A修飾的一小部分mRNA外，mRNA翻譯的變化可以忽略不計(jì),。這些數(shù)據(jù)與DF1或METTL3（兩者都可結(jié)合整個(gè)轉(zhuǎn)錄本中m6A）可增強(qiáng)翻譯的觀(guān)點(diǎn)不一致,。根據(jù)一些細(xì)胞類(lèi)型的多聚核糖體分析，這些研究似乎也支持METTL3在翻譯中的作用,，但這些影響不大/比較溫和（modest）,。需要進(jìn)行更多的研究來(lái)確定m6A是否具有增強(qiáng)mRNA翻譯的一般作用以及所涉及的確切機(jī)制。一些關(guān)于m6A在調(diào)控剪接中的作用最有力的證據(jù)來(lái)自于對(duì)黑腹果蠅的研究,，其中內(nèi)含子的m6A可影響到性別決定的核心基因Sex lethal的剪接,。在哺乳動(dòng)物中，m6A和mRNA剪接之間的聯(lián)系還不太清楚（這篇綜述是2019年的,，其實(shí)現(xiàn)在已經(jīng)有比較多的研究了）,。為了確定m6A是否調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的可變剪接，一個(gè)主要的方法是確定m6A是否位于外顯子或內(nèi)含子剪接位點(diǎn)附近,，在那里m6A可以直接影響剪接,。然而，在內(nèi)含子區(qū)域定位m6A是具有挑戰(zhàn)性的,，因?yàn)榧?xì)胞中內(nèi)含子RNA的數(shù)量非常少,。一些研究小組表明，m6A可位于外顯子5'剪接位點(diǎn)附近。然而,，其他研究人員在進(jìn)行高分辨率的m6A研究時(shí)發(fā)現(xiàn),，在外顯子5'剪接位點(diǎn)附近并沒(méi)有m6A的富集，在內(nèi)含子中缺乏m6A,。然而,，其他研究人員則在外顯子和內(nèi)含子區(qū)域的剪接點(diǎn)附近都發(fā)現(xiàn)了m6A。在所有案例中,，檢查新生 RNA 并可發(fā)現(xiàn)不同的m6A模式,。準(zhǔn)確的分析和映射（mapping）方法或用于制備新生（nascent）RNA的方法可能會(huì)解釋這些差異。不管在剪接點(diǎn)附近是否發(fā)現(xiàn)了m6A,，大多數(shù)研究都表明METTL3依賴(lài)性的剪接事件數(shù)量很少,。在胚胎干（ES）細(xì)胞中，與METTL3基因被敲除的ES細(xì)胞相比,，只有一小部分已知的可變剪接外顯子的剪接發(fā)生了改變,。這項(xiàng)觀(guān)察是在兩項(xiàng)獨(dú)立的研究中進(jìn)行的，它們使用不同的算法來(lái)檢測(cè)可變剪接,。在一項(xiàng)研究中,，在METTL3基因敲除的ES細(xì)胞中,，241964個(gè)外顯子中只有360個(gè)是發(fā)生了可變剪接的,。在另一項(xiàng)研究中，約24萬(wàn)個(gè)外顯子中的1269個(gè)外顯子在METTL3基因敲除的ES細(xì)胞中出現(xiàn)了可變剪接,。這些外顯子中只有34個(gè)含有m6A,。在另一項(xiàng)研究中，在METTL3基因敲除的ES細(xì)胞中只觀(guān)察到了360個(gè)存在差異的可變剪接事件,，其中只有不到三分之一含有m6A位點(diǎn),。總之,，這些研究表明,，m6A在直接調(diào)控mRNA剪接方面的作用有限。然而,，即使m6A可能只影響了少數(shù)基因的剪接,，但這些依賴(lài)m6A的剪接事件可能在功能上仍然是重要的。如果m6A確實(shí)影響剪接,，YTHDC1（也被稱(chēng)為DC1）可能參與了其中,，因?yàn)樗c剪接調(diào)節(jié)因子包括SAM68、SC35,、SRSF1和SRSF3（見(jiàn)下文reader部分）之間存在相互作用,，從而表明DC1與剪接之間存在聯(lián)系。另一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題是，m6A耗竭后所觀(guān)察到的剪接改變可能是一種間接影響,。例如,，一些被注釋最多的m6A位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本是些常見(jiàn)的剪接調(diào)節(jié)因子，如SON44,、HNRNPC38和HNRNPF45,。因此，m6A的耗竭可能會(huì)影響剪接調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),，從而難以區(qū)分m6A對(duì)mRNA剪接的直接影響和由剪接調(diào)節(jié)蛋白水平改變介導(dǎo)的間接影響,。m6A修飾的mRNA被定向調(diào)控的一個(gè)主要機(jī)制是通過(guò)液-液相分離的過(guò)程。通過(guò)研究含YTH結(jié)構(gòu)域家族（DF）蛋白的氨基酸序列,，發(fā)現(xiàn)了一些m6A和液-液相分離之間的聯(lián)系,，這些蛋白都含有一個(gè)大的富含谷氨酰胺/脯氨酸/甘氨酸的約30kDa的低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域。一些低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域之間具有相互作用的能力,，并能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)“相分離”成凝膠,、聚合物或液滴。DF蛋白被證明在與含有多個(gè)m6A的RNAs結(jié)合（incubated）時(shí)可相分離成液滴,。這些RNA可招募和并置（juxtapose）DF蛋白,，使它們發(fā)生相分離，形成RNA-蛋白液滴,。這些富含m6A的mRNA液滴隨后被分割成內(nèi)源性相分離的液滴,，如應(yīng)激顆粒、P-小體或神經(jīng)元RNA顆粒（圖2）,。因此,，m6A可使mRNA更有可能分到這些無(wú)膜的小室中，在這些小室中,，mRNA可能會(huì)被儲(chǔ)存,、降解或被用于將mRNA運(yùn)送到神經(jīng)元的樹(shù)突（arbors）中。值得注意的是,，當(dāng)多個(gè)m6A殘基以簇狀（clusters）存在時(shí),，m6A對(duì)mRNA降解的影響最為突出。m6A簇能產(chǎn)生突出效應(yīng)的原因可能是這些簇在誘導(dǎo)DF蛋發(fā)生相分離方面特別有效,，從而使mRNA能更有效地被靶向到參與mRNA降解的相分離小室,。m6A可能通過(guò)結(jié)合DC1來(lái)加強(qiáng)mRNA從細(xì)胞核的輸出。DC1和SRSF3之間的相互作用可能會(huì)促進(jìn)mRNA的輸出,，因?yàn)镾RSF3是NXF1依賴(lài)性的mRNA輸出途徑中的一個(gè)關(guān)鍵銜接蛋白,。一致的是，缺乏RNA去甲基化酶ALKBH5的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出m6A的增加,，也表現(xiàn)出mRNA的輸出加速,。然而，許多mRNA缺乏m6A，但仍然會(huì)從細(xì)胞核中輸出,，因此還不清楚為什么m6A仍被用于輸出,。此外，幾乎沒(méi)有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄組中的mRNA輸出率有整體性的變化,。然而,，這些研究也指出了m6A在影響mRNA輸出途徑方面發(fā)揮作用的可能性。m6A是由一個(gè)多亞單位的writer復(fù)合體以高度特異性的方式添加到mRNA上的,，其中只有某些mRNA含有m6A,，而在這些mRNA中，只有一小部分潛在的m6A位點(diǎn)會(huì)被甲基化,。這種轉(zhuǎn)錄本特異性和位點(diǎn)特異性的基礎(chǔ)仍不甚明了,。盡管最近的研究主要集中在mRNA中的m6A，但細(xì)胞的總RNA中絕大部分的m6A實(shí)際上位于更豐富的核糖體RNA中,。哺乳動(dòng)物的基因組共編碼了四種甲基轉(zhuǎn)移酶,，以在不同的RNA中產(chǎn)生m6A修飾。mRNA和其他RNA聚合酶II來(lái)源的轉(zhuǎn)錄本中的m6A主要由METTL3-METTL14異構(gòu)體產(chǎn)生,，其中METTL3是酶的組成部分,，METTL14是一種異構(gòu)激活體，也與靶RNA結(jié)合,。28S核糖體RNA（rRNA）中的單個(gè)m6A則由rRNA N6-腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶ZCCHC4所形成,，而18S亞單位rRNA中的單個(gè)m6A由METTL5-TRMT112復(fù)合物所形成，其中METTL5是催化亞單位,，TRMT是一種異生銜接蛋白（allosteric adaptor）,。最后,，U6小核糖核酸（snRNA）中的單個(gè)m6A（一種參與剪接的snRNA）,，是由METTL16所催化的。METTL16還可催化在MAT2A mRNA的U6樣序列中形成m6A,，MAT2A可編碼負(fù)責(zé)S-腺苷蛋氨酸（SAM）生物合成的酶,。此外，METTL16還可催化少量其他mRNA和非編碼RNA中m6A的形成,。METTL3-METTL14異二聚體復(fù)合物修飾mRNA中絕大部分的m6A位點(diǎn),。在小鼠ES細(xì)胞中，METTL3的基因組缺失或CRISPR介導(dǎo)的METTL14失活,，可導(dǎo)致poly(A)RNA中99%以上的m6A總量丟失,。因此，poly(A)RNA中很少有m6A是由METTL16或其他潛在甲基轉(zhuǎn)移酶催化的,?；谶@個(gè)原因，METTL3或METTL14的缺失已被用來(lái)研究許多m6A依賴(lài)性的功能。在本文中,，我們重點(diǎn)研究METTL3-METTL14復(fù)合物是如何被調(diào)控的,，以及它如何決定m6A在轉(zhuǎn)錄組中的分布。METTL3作為mRNA中的m6A形成酶的這一發(fā)現(xiàn),，揭示了m6A與細(xì)胞生理學(xué)之間的聯(lián)系,。最初的純化研究顯示，甲基轉(zhuǎn)移酶的活性是由一個(gè)>1 MDa的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物介導(dǎo)的,，該復(fù)合物在色譜（chromatography）過(guò)程中會(huì)迅速解離并失活,。然而，將由一個(gè)約200 kDa的復(fù)合物和一個(gè)約875 kDa的復(fù)合物組成的兩個(gè)部分混合在一起,，可以重建甲基轉(zhuǎn)移酶的活性?，F(xiàn)在已知較小的復(fù)合物，即甲基轉(zhuǎn)移酶A（MT-A）,，包含METTL3和METTL14,，而另一個(gè)較大的復(fù)合物，即甲基轉(zhuǎn)移酶B（MT-B）,，可能包含額外的銜接蛋白,，促進(jìn)對(duì)METTL3與RNA的招募。通過(guò)將3H-SAM交聯(lián)到MT-A復(fù)合物中一個(gè)約70kDa的蛋白上,，確定了百萬(wàn)級(jí)道爾頓復(fù)合物中的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白,。所克隆的酶，最初被稱(chēng)為MT-A70（MT-A亞單位,，70kDa）,，現(xiàn)在被稱(chēng)為METTL3，在酵母,、癌細(xì)胞和植物發(fā)育中實(shí)現(xiàn)抗體開(kāi)發(fā)和METTL3缺失相關(guān)的研究,，而促進(jìn)了m6A定位方法的發(fā)展,。盡管對(duì)writer復(fù)合物是如何被調(diào)控的知之甚少,，但其快速解離可能與生理有關(guān)；體內(nèi)MT-A和MT-B樣成分的調(diào)控組裝可能會(huì)控制其活性,。METTL14：METTL3的異構(gòu)銜接蛋白 最近的研究表明,，一些m6A位點(diǎn)是由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14形成的,。METTL14被純化后,，并被證明具有METTL3非依賴(lài)性的體外m6A合成能力,。這項(xiàng)研究提出，METTL3和METTL14可組裝成一個(gè)復(fù)合物,，每個(gè)蛋白都能甲基化不同的靶點(diǎn),。另一項(xiàng)研究得出了不同的結(jié)論,，認(rèn)為是METTL14可穩(wěn)定METTL3，并且這些蛋白共同形成m6A,。試圖解決這種差異的第一項(xiàng)研究使用了各種基因組中假定的腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析,。這項(xiàng)研究表明，METTL14序列中有一個(gè)中斷的SAM結(jié)合motif,，這表明它沒(méi)有催化活性。因此,，作者提出METTL14是METTL3-METTL14復(fù)合物中一個(gè)無(wú)活性的伴侶,。此后不久,，有三個(gè)研究小組描繪了METTL3-METTL14復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，證明METTL14確實(shí)是無(wú)活性的,，因?yàn)樗狈AM結(jié)合位點(diǎn)，從而證明了這個(gè)假設(shè),。總的來(lái)說(shuō),，晶體結(jié)構(gòu)表明METTL3和METTL14會(huì)形成單個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶，其中METTL14可能包含RNA結(jié)合位點(diǎn)，是METTL3酶活性的異構(gòu)活化劑,。那么，為什么早期的研究結(jié)果報(bào)告說(shuō)METTL14具有顯著的甲基轉(zhuǎn)移酶活性,？隨后的工作表明,，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)和純化的人類(lèi)METTL14與METTL3的昆蟲(chóng)同源物可形成異二聚體，表明早期研究中歸因于METTL14的酶活性實(shí)際來(lái)自于共同純化且污染了的昆蟲(chóng)METTL3,。這些研究共同推翻了METTL14是負(fù)責(zé)mRNA中m6A形成的第二個(gè)獨(dú)立甲基轉(zhuǎn)移酶的觀(guān)點(diǎn),。盡管有這些證據(jù),，說(shuō)METTL14是第二種甲基轉(zhuǎn)移酶的觀(guān)點(diǎn)在文獻(xiàn)中仍然很普遍,，部分原因是由于在CRISPR介導(dǎo)METTL3失活后，m6A水平仍然存在,。這與其他研究中METTL3的基因組缺失會(huì)導(dǎo)致m6A完全喪失形成鮮明對(duì)比,。在一些研究中所看到的殘留m6A可能是由于CRISPR介導(dǎo)的METTL3或METTL14發(fā)生不完全缺失,，導(dǎo)致形成酶亞型（hypomorphs）。事實(shí)上,，CRISPR誘導(dǎo)突變引起外顯子跳躍也已被證明,。當(dāng)使用CRISPR技術(shù)時(shí),，METTL3和METTL14似乎非常容易形成亞形,，因此驗(yàn)證METTL3或METTL14蛋白已被刪除,，以及殘留的截短蛋白缺乏酶活性就變得至關(guān)重要。由于m6A的motif DRACH（D=A、G或U,；R=G或A,；H=A、C或U）在mRNA中每隔約57個(gè)核苷酸就出現(xiàn)一次,，因此每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都被預(yù)測(cè)為有許多潛在的甲基化位點(diǎn),。然而，其實(shí)這些DRACH序列中很少有被甲基化的,。此外,，盡管DRACH序列廣泛存在，但只有特定的轉(zhuǎn)錄本才會(huì)有m6A修飾。關(guān)于這種位點(diǎn)特異性和轉(zhuǎn)錄本特異性甲基化的基礎(chǔ)/原因還不甚明了,。選擇轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行甲基化的一個(gè)機(jī)制可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子將writer復(fù)合物募集到特定的啟動(dòng)子（圖3）,。例如,，在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中，SMAD2/3轉(zhuǎn)錄因子與METTL3,、METTL14和METTL3銜接蛋白WTAP結(jié)合,，從而促進(jìn)SMAD2/3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本在TGFβ信號(hào)作用下的甲基化。約有150個(gè)基因被證明是通過(guò)這一機(jī)制調(diào)節(jié)的,。在急性髓性白血?。ˋML）細(xì)胞中,，CAATT-box結(jié)合蛋白CEBPZ與約70個(gè)不同的基因啟動(dòng)子結(jié)合并招募METTL3,，以上調(diào)這些基因所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的甲基化,。重要的是,，這些機(jī)制似乎只介導(dǎo)了細(xì)胞中含有m6A的轉(zhuǎn)錄本總數(shù)中的很小一部分，表明還有其他目前未知的機(jī)制來(lái)解釋轉(zhuǎn)錄本組中大部分的m6A,。其他啟動(dòng)子的特征,，如CpG島的數(shù)量和啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),，也已被發(fā)現(xiàn)與mRNA中的m6A水平相關(guān)，并可能招募可解釋甲基化特異性的因素,。轉(zhuǎn)錄本的特異性和m6A的位置也可能取決于組蛋白的修飾。Mapping研究表明,，m6A優(yōu)先存在于那些長(zhǎng)的內(nèi)部外顯子（internal exons）,。外顯子有其獨(dú)特的特征，如核糖體密度大大高于內(nèi)含子,，高水平的某些組蛋白修飾,，如組蛋白H3賴(lài)氨酸36的三甲基化（H3K36me3）和H4K20me1。因此,，染色質(zhì)標(biāo)記可能會(huì)指導(dǎo)mRNA甲基化,。最近的研究報(bào)道，H3K36me3與mRNA中的m6A形成有關(guān),。有人提出METTL14和H3K36me3之間的相互作用是為了引導(dǎo)writer復(fù)合物運(yùn)到新生RNA和轉(zhuǎn)錄本的特定區(qū)域（圖3）,。將負(fù)責(zé)H3K36me3形成的甲基轉(zhuǎn)移酶Setd2敲除，可導(dǎo)致mRNA中m6A水平下降約40%,，從而將這一途徑與相當(dāng)一部分的甲基化事件聯(lián)系起來(lái),。然而，需要H3K36me3才能進(jìn)行甲基化的特定轉(zhuǎn)錄本或特定位點(diǎn)尚不完全清楚,。是什么決定了哪個(gè)DRACH位點(diǎn)是甲基化的靶點(diǎn),？
除了長(zhǎng)的內(nèi)部外顯子,，m6A也在終止密碼子附近有被發(fā)現(xiàn)。終止密碼子本身不太可能指導(dǎo)甲基化，因?yàn)榧谆l(fā)生在細(xì)胞核中,，而終止密碼子是在細(xì)胞質(zhì)中被核糖體識(shí)別到。相反,，mRNA中的末端外顯子-外顯子連接（通常在終止密碼子附近）可能是導(dǎo)致終止密碼子附近有m6A富集的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征,。這個(gè)區(qū)域的m6A富集出現(xiàn)在新生的、與染色質(zhì)結(jié)合的mRNA中，進(jìn)一步表明這種終止密碼子附近的m6A富集是由mRNA生命周期早期的m6A修飾事件所決定的,，而不是在這些區(qū)域之外含有m6A的mRNA發(fā)生選擇性胞質(zhì)降解的結(jié)果,。由于甲基化是共轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生的，轉(zhuǎn)錄期間的事件可能決定了哪些DRACH位點(diǎn)被甲基化,。m6A writer復(fù)合體對(duì)H3K36me3標(biāo)記的定位可以賦予新生轉(zhuǎn)錄本位點(diǎn)特異性,。另外，METTL3也已被檢測(cè)到可與RNA聚合酶II結(jié)合,，這表明m6A writer復(fù)合體可以被RNA聚合酶II招募到以誘導(dǎo)甲基化（圖3）,。通過(guò)使用化學(xué)抑制劑或RNA聚合酶II突變體，以減緩RNA聚合酶II的速度后,，也增加了METTL3的招募和m6A在mRNA中的水平,。然而，應(yīng)該注意的是,，目前還不清楚RNA聚合酶II是否通常在終止密碼子區(qū)域附近或在長(zhǎng)的內(nèi)部外顯子中變慢,，這也可以解釋m6A在這些部位富集的原因。最后,，writer復(fù)合體的RNA結(jié)合成分可能使writer復(fù)合體靶向mRNA并促進(jìn)相鄰位點(diǎn)發(fā)生甲基化（圖3）,。甲基化復(fù)合體的成分RBM15/15B含有RNA結(jié)合域，而RBM15/15B的結(jié)合位點(diǎn)在mRNA的m6A位點(diǎn)附近,。目前還不清楚有多少m6A位點(diǎn)是writer復(fù)合物被RBM15/15B招募到特定轉(zhuǎn)錄本區(qū)域后所修飾的結(jié)果,。盡管人們認(rèn)為m6A的形成主要是在核內(nèi)，但在某些情況下,，m6A修飾也可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),。例如，盡管RNA病毒的基因組是在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄的,，但仍可以在其基因組中獲得m6A修飾,。這些轉(zhuǎn)錄本獲得m6A的能力表明，有一些METTL3存在于細(xì)胞質(zhì)中,。也有其他研究在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到了METTL3,。目前還不清楚在細(xì)胞質(zhì)中所組裝的含有METTL3的writer復(fù)合物是否與經(jīng)典核writer復(fù)合物相似。m6A影響mRNA命運(yùn)的一個(gè)主要機(jī)制是通過(guò)招募m6A結(jié)合蛋白,。含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A結(jié)合蛋白,，并為理解m6A在mRNA中的作用提供了機(jī)制基礎(chǔ)（表2）。m6A還可以通過(guò)破壞mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來(lái)影響mRNA,，從而影響不同RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合,。在本文中，我們總結(jié)了關(guān)于m6A readers的主要發(fā)現(xiàn),，并就如何鑒定真正的m6A結(jié)合蛋白提供了一些見(jiàn)解,。1.1 YTH結(jié)構(gòu)域的m6A結(jié)合模塊含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與m6A結(jié)合的發(fā)現(xiàn)來(lái)自于體外m6A-RNA pull-down實(shí)驗(yàn),，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了YTHDF2和YTHDF3。根據(jù)YTH結(jié)構(gòu)域與其他RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源性,，之前有人認(rèn)為它是一個(gè)與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,。隨后的研究正式證明，約含150個(gè)氨基酸的YTH結(jié)構(gòu)域以m6A依賴(lài)性的方式結(jié)合RNA,。哺乳動(dòng)物基因組中有五個(gè)含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白,，它們分為三類(lèi)。YTHDC1（也叫DC1）,、YTHDC2（也叫DC2）和YTHDF（叫DF）蛋白家族,。DC1主要是核型，DF蛋白是胞質(zhì)型,，DC2既可以是核型又可以是胞質(zhì)型,。結(jié)構(gòu)研究表明，含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與m6A甲基部分結(jié)合的選擇性主要是通過(guò)一個(gè)“色氨酸籠（tryptophan cage）”實(shí)現(xiàn)的,，其中有兩個(gè)或三個(gè)色氨酸包裹著甲基,。DC1與mRNA剪接、非編碼RNA XIST69介導(dǎo)的表觀(guān)遺傳沉默和mRNA的核輸出有關(guān),。DC1被發(fā)現(xiàn)定位在細(xì)胞核中動(dòng)態(tài)的和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)中,，DC1的原始名稱(chēng)叫YT521-B86，這些結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為“YT小體”,。根據(jù)DC1和SRSF蛋白的共同定位，以及對(duì)核小體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,，YT小體現(xiàn)在被認(rèn)為是核斑點(diǎn)（nuclear speckles）,。值得注意的是，和DF蛋白一樣,，DC1包含有一個(gè)大的低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域,。因此，相分離可能對(duì)DC1的功能至關(guān)重要,。由于核斑點(diǎn)與活躍的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)有關(guān),，DC1可能在mRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化后不久就與它們結(jié)合。結(jié)合后,，DC1可能影響剪接,。DC1與SRSF3結(jié)合，這被認(rèn)為是使DC1通過(guò)置換SRSF10來(lái)促進(jìn)外顯子包含,。這些影響與m6A通過(guò)招募特定的剪接因子在塑造RNA剪接動(dòng)力學(xué)方面的潛在作用相一致,。然而，目前還不清楚剪接調(diào)節(jié)是否是m6A的一個(gè)主要功能,，以及m6A介導(dǎo)的剪接調(diào)節(jié)是否由DC1或其他m6A依賴(lài)性機(jī)制所介導(dǎo)（見(jiàn)上文關(guān)于mRNA剪接的部分）,。DC1似乎也能介導(dǎo)非編碼RNA中m6A的功能,。使用紫外交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）方法對(duì)YTH蛋白進(jìn)行的全轉(zhuǎn)錄組結(jié)合的研究表明，DC1優(yōu)先結(jié)合非編碼RNA中的m6A位點(diǎn),，如XIST,、NEAT1和MALAT1，而DF家族成員優(yōu)先結(jié)合mRNA的m6A位點(diǎn),。盡管m6A存在于不同的非編碼RNA中,，如NEAT1和MALAT1，但僅在XIST中對(duì)其功能進(jìn)行了研究（現(xiàn)在有不少了）,。XIST是一種非編碼RNA,，有助于X染色體的失活和X染色體上基因的沉默。m6A的耗竭可通過(guò)招募DC1增強(qiáng)XIST介導(dǎo)的沉默,，這可能會(huì)促進(jìn)其他表觀(guān)遺傳沉默蛋白的招募,。而DC1是否有助于其他非編碼RNA的功能則尚不清楚。YTHDF家族包括三個(gè)高度相似的旁系同源物,。YTHDF1,、YTHDF2和YTHDF3（也分別稱(chēng)為DF1、DF2和DF3）,。DF蛋白在其整個(gè)長(zhǎng)度上具有非常高的氨基酸一致性,。除了DF1-DF3中幾乎相同的YTH結(jié)構(gòu)域外，序列的其余部分（約400個(gè)氨基酸）是一個(gè)低復(fù)雜度的區(qū)域,，缺乏可識(shí)別的模塊化蛋白結(jié)構(gòu)域,，包含幾個(gè)類(lèi)似于朊病毒的P/Q/N結(jié)構(gòu)域。如上所述,，這些結(jié)構(gòu)域可使DF蛋白發(fā)生相分離,，通常與結(jié)合的m6A mRNA一起發(fā)生。這種相分離特性以m6A mRNA為靶標(biāo),，并由 P小體,、應(yīng)激顆粒和其他RNA-蛋白組件處理。雖然這三種DF蛋白都有同樣的能力來(lái)加強(qiáng)m6A mRNA的相分離,，但關(guān)于它們是否各自對(duì)m6A mRNA有專(zhuān)門(mén)的影響,，卻有著矛盾的證據(jù)。早期的研究報(bào)告指出,，三種DF蛋白對(duì)m6A mRNA的作用各不相同,。DF1可增強(qiáng)m6A修飾的mRNA發(fā)生翻譯，DF2促進(jìn)其降解,，而DF3兼具有這兩種功能,。然而，其他使用報(bào)告RNA降解或mRNA去乙?；堑膶?shí)驗(yàn)表明,，DF1/2/3在mRNA降解中都有類(lèi)似的作用,。另外，所有三個(gè)DF蛋白似乎都能在m6A mRNA 上募集到主要的細(xì)胞mRNA去腺苷酸化復(fù)合物,，稱(chēng)為CCR4-NOT,。DF2以前被證明在經(jīng)歷了熱休克誘導(dǎo)后可重定位到細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)壓力誘導(dǎo)的m6A writing途徑,；然而,，隨后的研究發(fā)現(xiàn)了沒(méi)有壓力誘導(dǎo)所發(fā)生的DF2核重定位，這表明DF2在調(diào)節(jié)m6A writing途徑方面沒(méi)有選擇性的作用,。此外,，DF2可能會(huì)促進(jìn)其結(jié)合的mRNA發(fā)生核酸內(nèi)切。鑒于DF蛋白之間序列的高度相似性,，目前還不清楚DF如何介導(dǎo)不同的功能,；需要更多的研究來(lái)解決在胞質(zhì)mRNA上DF功能的這些差異。另一個(gè)問(wèn)題是DF蛋白是否與mRNA中不同或相同的m6A位點(diǎn)結(jié)合,。一些基于CLIP的研究表明,，大多數(shù)m6A只與三個(gè)DF分子中的一個(gè)發(fā)生結(jié)合，而另一些研究表明,，所有m6A位點(diǎn)與所有DF分子的結(jié)合方式基本相同,。解決這一差異并確定DF蛋白是否結(jié)合相同或不同的m6A位點(diǎn)對(duì)于深刻理解m6A的機(jī)制非常重要。1.4 DC2是一種主要在睪丸中起作用的m6A reader與其他廣泛表達(dá)的YTH蛋白不同,，DC2富集在睪丸中,。YTHDC2基因敲除的小鼠會(huì)表現(xiàn)出精子發(fā)生的缺陷，但沒(méi)有其他明顯的發(fā)育缺陷,。DC2缺陷型生殖細(xì)胞可進(jìn)入減數(shù)分裂,，但會(huì)在沒(méi)有經(jīng)歷正常減數(shù)分裂基因表達(dá)程序的情況下發(fā)生過(guò)早和異常的中期而凋亡。DC2的結(jié)合特性有些與眾不同（unusual）,。與其他四個(gè)含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白不同（與m6A的RNA結(jié)合的親和力從200 nM到1 μM不等），DC2的YTH結(jié)構(gòu)域與m6A RNA的結(jié)合力更弱（~5 μM）,。YTHDC2結(jié)構(gòu)域保留了色氨酸籠,，因此似乎可以結(jié)合甲基化的腺嘌呤。然而,，DC2的YTH結(jié)構(gòu)域在預(yù)測(cè)會(huì)結(jié)合m6A相鄰殘基的區(qū)域表現(xiàn)出了序列的分歧,。基于CLIP對(duì)轉(zhuǎn)錄組中DC2結(jié)合位點(diǎn)的研究表明與m6A位點(diǎn)的重疊度很低,，而這與其他YTH結(jié)構(gòu)域蛋白有所不同,。因此，DC2的YTH結(jié)構(gòu)域可能會(huì)結(jié)合特殊m6A位點(diǎn)或使用不同的結(jié)合模式來(lái)影響m6A mRNA,。DC2有一個(gè)RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域,，與調(diào)節(jié)翻譯的RNA解旋酶（如DHX29）有相似之處,，表明它可能會(huì)促進(jìn)mRNA的翻譯。這一假設(shè)得到了研究結(jié)果的支持,，當(dāng)DC2被人為地拴在reporter RNA上時(shí),，翻譯會(huì)上調(diào)。而其他研究表明,，DC2可通過(guò)招募5'-3'外切核酸酶Xrn1來(lái)介導(dǎo)mRNA的降解,。在小鼠睪丸中，DC2的耗竭可稍微上調(diào)m6A含量高那些mRNA的表達(dá),?？偟膩?lái)說(shuō)，所報(bào)道的作用非常小,，這也表明DC2的功能還沒(méi)有被完全的闡明,。此外，m6A也可能間接地招募RNA結(jié)合蛋白,。盡管m6A可以與U形成堿基對(duì),，但m6A-U堿基對(duì)比A-U堿基對(duì)要弱，在短RNA螺旋中存在m6A會(huì)破壞它的穩(wěn)定性,，使熔化（melting）溫度降低5℃或更多,。因此，m6A會(huì)降低RNA形成結(jié)構(gòu)的能力,，有利于RNA形成線(xiàn)性,、未折疊的形式。這種結(jié)構(gòu)的減少使得那些結(jié)合單鏈motif的RNA結(jié)合蛋白有更多機(jī)會(huì)接觸到RNA,。這一觀(guān)點(diǎn)首先在HNRNPC中得到了證實(shí),，這是一種豐度較高的核型RNA結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)包括剪接在內(nèi)的pre-mRNA加工,。m6A的存在為HNRNPC提供了更多機(jī)會(huì)接近m6A位點(diǎn)附近的幾個(gè)結(jié)合點(diǎn),。m6A傾向于發(fā)生在轉(zhuǎn)錄組的非結(jié)構(gòu)化區(qū)域，這一現(xiàn)象已得到來(lái)自全轉(zhuǎn)錄組RNA結(jié)構(gòu)檢測(cè)的支持,。這種m6A誘導(dǎo)RNA去折疊/展開(kāi)（unfolding）的概念被稱(chēng)為“m6A結(jié)構(gòu)開(kāi)關(guān)”,。重要的是，m6A誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換可促進(jìn)基本上任何靠近m6A位點(diǎn)或與之重疊結(jié)合位點(diǎn)的RNA結(jié)合蛋白發(fā)生結(jié)合,。事實(shí)上,，結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，其他在一些m6A位點(diǎn)附近結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白,，當(dāng)沒(méi)有m6A時(shí),，其結(jié)合效率會(huì)降低。這些蛋白包括HNRNPG（一種參與剪接的RNA結(jié)合蛋白）,，以及A2B1（HNRNPA2B1,，一種參與初級(jí)microRNA加工的RNA結(jié)合蛋白）,。任何在m6A殘基附近結(jié)合的蛋白質(zhì)在有m6A存在時(shí)都會(huì)改變結(jié)合效率。很難確定一種RNA結(jié)合蛋白是直接與m6A結(jié)合,，還是由于m6A誘導(dǎo)RNA去折疊以及附近結(jié)合位點(diǎn)的可及性增加而與有m6A的RNA發(fā)生結(jié)合,。例如，盡管早期的凝膠遷移試驗(yàn)表明,，HNRNPA2B1可結(jié)合m6A,，但最近的研究表明，是m6A誘導(dǎo)RNA展開(kāi),，使被標(biāo)記的RNA更容易被HNRNPA2B1接觸到,。因此，比較非甲基化和甲基化的RNA很復(fù)雜,，因?yàn)檫@些RNA會(huì)因甲基化狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的不同而存在差異,。因此，在研究m6A是否可直接結(jié)合RNA結(jié)合蛋白時(shí),，使用不能夠形成結(jié)構(gòu)的RNA至關(guān)重要,。此外，m6A也可以排斥某些RNA結(jié)合蛋白,。這些蛋白被稱(chēng)為“anti-readers”,，如果m6A出現(xiàn)在它們的結(jié)合位點(diǎn)上，并且甲基干擾了結(jié)合,，它們就會(huì)被m6A取代,。對(duì)結(jié)合同一RNA甲基化和非甲基化版本的蛋白分析表明，G3BP1（一種參與應(yīng)激顆粒形成的RNA結(jié)合蛋白）會(huì)被m6A所排斥,?；诮Y(jié)構(gòu)和結(jié)合分析的研究發(fā)現(xiàn)，LIN28A（參與microRNA加工的核心多能調(diào)節(jié)因子）,，和EWSR1（主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子）,，也被發(fā)現(xiàn)是anti-m6A readers。目前仍不清楚m6A介導(dǎo)的anti-reader是否介導(dǎo)了m6A相關(guān)的生物學(xué)功能,。核糖體也可能作為m6A readers發(fā)揮作用,。單分子核糖體轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)的研究表明，細(xì)菌核糖體會(huì)在含有m6A密碼子的mRNA上滯留,。盡管細(xì)菌核糖體與哺乳動(dòng)物核糖體不同，但核糖體分析的數(shù)據(jù)表明,，哺乳動(dòng)物核糖體也有在m6A位點(diǎn)停滯的傾向,。這種機(jī)制對(duì)m6A mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯的影響程度仍不清楚。使用m6A RNA探針和質(zhì)譜從pull-down實(shí)驗(yàn)中鑒定出了其他的m6A結(jié)合蛋白,。這些蛋白包括FMRP,，以及IGF2BP蛋白（IGF2BP1,，IGF2BP2和IGF2BP3）。這些RNA結(jié)合蛋白中的每一個(gè)似乎都能增強(qiáng)m6A mRNA的穩(wěn)定性,。然而,，目前仍不清楚這些蛋白是否直接與m6A結(jié)合。CLIP研究則同時(shí)提供了支持和反對(duì)這些蛋白是真正m6A結(jié)合蛋白的證據(jù),。對(duì)一些CLIP研究中鑒定的peak進(jìn)行motif分析,，發(fā)現(xiàn)FMRP和IGF2BP蛋白結(jié)合的序列motif類(lèi)似于m6A的DRACH位點(diǎn)；然而,，其他的CLIP研究表明,，IGF2BP蛋白結(jié)合的是不同的共有序列。這些蛋白似乎不是真正的readers的另一個(gè)原因是,，如CLIP reads分布所顯示的那樣,，它們?cè)谌D(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的結(jié)合模式與富集在終止密碼子的m6A分布不一致。此外,，與YTH結(jié)構(gòu)域相反,，F(xiàn)MRP和IGF2BP蛋白對(duì)有m6A修飾的RNA的結(jié)合親和力較弱，區(qū)分甲基化RNA和非甲基化RNA的能力較差,。因此,，這些蛋白沒(méi)有顯示出直接型m6A readers的那種m6A結(jié)合類(lèi)型。最近的研究為最初觀(guān)察到的關(guān)于FMRP和IGF2BPs可直接結(jié)合m6A提供了其他解釋,。FMRP被發(fā)現(xiàn)可直接結(jié)合DF2,，這與在DF蛋白的“相互作用組學(xué)（interactome）”中發(fā)現(xiàn)了FMRP的其他研究一致。因此,，F(xiàn)MRP可能通過(guò)與DF蛋白的相互作用間接地與m6A RNA產(chǎn)生聯(lián)系,。同樣，IGF2BP蛋白在pull-down研究中發(fā)現(xiàn)可與DF蛋白相互作用,，因此可能間接地與m6A RNA相互作用,。另一項(xiàng)研究表明，IGF2BPs可由于m6A導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換而與有m6A修飾的mRNA發(fā)生結(jié)合,。因此,，IGF2BPs可能會(huì)結(jié)合那些因m6A而未折疊的RNA。盡管如此,，F(xiàn)MRP和IGF2BPs還是可能在m6A信號(hào)中具有重要的作用,，但研究它們是作為DF蛋白的結(jié)合伴侶還是作為m6A的直接readers將具有重要意義。m6A“erasers”是將m6A轉(zhuǎn)化為A的去甲基化酶,，也塑造了m6A表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組,。盡管對(duì)m6A的早期研究表明，m6A erasers對(duì)m6A的功能至關(guān)重要，它可以動(dòng)態(tài),、快速,、信號(hào)依賴(lài)性的方式催化m6A的去修飾，但現(xiàn)在看來(lái),，m6A erasers在正常生理?xiàng)l件下的作用有限,。事實(shí)上，生化追蹤和代謝標(biāo)記的研究表明,，在HeLa細(xì)胞的生命周期中,，mRNA中的m6A水平是穩(wěn)定的。相反,，m6A的擦除（去修飾）似乎僅限于特定的組織,，如睪丸，或在特定壓力和疾病相關(guān)的條件下,。哪個(gè)核苷酸會(huì)被FTO去甲基化,？ 對(duì)FTO序列的分析顯示，它與雙加氧酶的ALKB家族是“遠(yuǎn)親”（distant homology）,，ALKB家族可對(duì)被外源性試劑烷基化的DNA和RNA核苷酸去甲基化,。基于這些,，F(xiàn)TO被發(fā)現(xiàn)對(duì)甲基化的DNA核苷酸具有脫甲基酶活性,，結(jié)果表明FTO對(duì)這些底物的活性很弱。然而,，隨后的一項(xiàng)研究提出,，F(xiàn)TO是RNA中3-甲基尿苷（m3U）的脫甲基酶，因?yàn)榕c甲基化的脫氧核苷酸相比,，它對(duì)這種核糖核苷酸的活性更高,。隨后的研究顯示，F(xiàn)TO對(duì)mRNA中的m6A具有更高的去甲基化酶活性,，從而發(fā)現(xiàn)m6A才是FTO的真正底物,。然而，一些研究表明,，m6A可能不是FTO的生理性相關(guān)靶標(biāo),。例如，對(duì)小鼠FTO敲除的大腦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行m6A mapping研究并未發(fā)現(xiàn)m6A修飾位點(diǎn)有明顯增加,，而且從敲除了FTO基因的小鼠胚胎和細(xì)胞中所得到的mRNA中,，其m6A水平也沒(méi)有增加。最近使用Mazter-Seq繪制的全轉(zhuǎn)錄組m6A化學(xué)計(jì)量（stoichiometry）結(jié)果也表明,，全轉(zhuǎn)錄組的m6A 化學(xué)計(jì)量不受FTO的耗竭所影響,。體外酶促分析的結(jié)果表明,，與相關(guān)的酶相比，F(xiàn)TO會(huì)以異常低的反應(yīng)速率對(duì)m6A進(jìn)行去甲基化,。最后，F(xiàn)TO也沒(méi)有以m6A序列特異性的方式對(duì)RNA進(jìn)行去甲基化,，而這是非特異性酶活性的標(biāo)志,。總之,，這些結(jié)果表明了m6A的非特異性反應(yīng),。探索FTO功能的重大進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)FTO對(duì)m6Am去甲基化的催化活性大大高于m6A。這一發(fā)現(xiàn)是基于對(duì)野生型和FTO基因敲除型小鼠miCLIP的m6A 峰值強(qiáng)度進(jìn)行詳細(xì)重新分析后的結(jié)果,，發(fā)現(xiàn)當(dāng)m6A位于5'UTR時(shí),，F(xiàn)TO缺陷型細(xì)胞中m6A水平有輕微的增加。重要的是,，5'UTR中的峰值通常反映的是m6Am,，因?yàn)閙6Am僅與mRNA中的m7G帽相鄰。當(dāng)在生化試驗(yàn)中直接進(jìn)行測(cè)試時(shí),，m6Am的去甲基化的比率會(huì)比m6A高100倍,。這種活性對(duì)序列背景高度敏感，因?yàn)槿ゼ谆枰猰7G,，這也表明FTO的生理底物是m6Am,。雖然FTO可以使mRNA中的m6Am去甲基化，但FTO基因敲除的細(xì)胞中,，poly(A) mRNA中m6Am在細(xì)胞水平中會(huì)有微妙的增加,。這促使我們用細(xì)胞的總RNA的miCLIP來(lái)分析FTO敲除型細(xì)胞中的其他RNA。m6Am化學(xué)計(jì)量的定量測(cè)量結(jié)果表明,，在FTO缺失的細(xì)胞中,，特定snRNA轉(zhuǎn)錄本中第一個(gè)轉(zhuǎn)錄核苷酸位置的m6Am水平增加了約1500%。在野生型細(xì)胞中,，大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中只有<5%的snRNA具有m6Am,。然而，F(xiàn)TO基因敲除的細(xì)胞增加了>50%的m6Am化學(xué)計(jì)量,，表明FTO通?？墒筸6Am去甲基化，從而使大多數(shù)的成熟snRNA在第一個(gè)編碼的核苷酸處含有Am,。值得注意的是,，F(xiàn)TO敲除的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出剪接缺陷。因?yàn)閟nRNAs會(huì)介導(dǎo)剪接,，所以snRNAs中的m6Am形式也有可能在剪接中發(fā)揮作用,。總的來(lái)說(shuō),，snRNAs中m6Am甲基化狀態(tài)的顯著改變證實(shí)了snRNAs是FTO的靶標(biāo)，并表明FTO的功能是調(diào)控snRNA而不是mRNA的甲基化,。FTO調(diào)節(jié)甲基化修飾而影響snRNAs的確切機(jī)制尚不清楚,。盡管FTO對(duì)細(xì)胞中的m6Am有著顯著地影響，但有人提出FTO可以作用于m6A,，盡管它對(duì)這種修飾的反應(yīng)率很低,。在特定的白血病亞型中耗盡FTO會(huì)導(dǎo)致m6A水平增加約20%。有人提出,，F(xiàn)TO在這些細(xì)胞中具有異常的細(xì)胞質(zhì)定位,，從而使m6A去甲基化。然而,，沒(méi)有特定的mRNA可使用SCARLET方法直接檢測(cè)其m6A水平,，以確定它是否確實(shí)受到FTO的調(diào)節(jié)。重要的是要確定一個(gè)m6A位點(diǎn),，該位點(diǎn)在m6A化學(xué)計(jì)量方面顯示出清晰而顯著的變化,，以便明確地確定FTO是mRNA的m6A去甲基酶。第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RNA去甲基化酶是ALKBH5,，它是在m6A去甲基化酶的篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的,。ALKBH5是一種內(nèi)源性m6A去甲基化酶，因?yàn)锳LKBH5的敲除和過(guò)量表達(dá)分別可導(dǎo)致細(xì)胞中m6A的增加和減少,。與FTO不同,，ALKBH5對(duì)m6Am沒(méi)有活性。由于A(yíng)LKBH5是核型的,，而且似乎定位于核斑點(diǎn),，所以ALKBH5很可能在核RNA中或在mRNA的核內(nèi)生物生成期間對(duì)m6A進(jìn)行去甲基化。ALKBH5似乎在小鼠的發(fā)育或生理方面沒(méi)有作用,，因?yàn)槌司由煞矫娴娜毕萃?，ALKBH5基因敲除型小鼠看起來(lái)很正常。值得注意的是,，ALKBH5在睪丸和女性生殖組織中富集,，這表明它介導(dǎo)了對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的m6A去甲基化事件。與正常細(xì)胞相反,，在某些癌細(xì)胞中ALKBH5似乎會(huì)被上調(diào),，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中。ALKBH5在缺氧情況下也可能被上調(diào),，其依據(jù)是利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析發(fā)現(xiàn),，缺氧感應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α?xí)cALKBH5的啟動(dòng)子結(jié)合。與此一致的是,，ALKBH5可被乳腺癌干細(xì)胞所暴露的缺氧環(huán)境所誘導(dǎo),。也有研究發(fā)現(xiàn)病毒感染后會(huì)誘導(dǎo)ALKBH5,。因此，ALKBH5可能會(huì)在不同的疾病背景下發(fā)生上調(diào),，以調(diào)節(jié)表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組,。特定的轉(zhuǎn)錄本和m6A位點(diǎn)可以介導(dǎo)ALKBH5表達(dá)增加的致癌作用。例如,，NANOG的mRNA（一個(gè)重要的多能性基因）,，在A(yíng)LKBH5水平升高的乳腺癌細(xì)胞中會(huì)表現(xiàn)出m6A水平下降。另一個(gè)潛在被ALKBH5所調(diào)節(jié)的mRNA是FOXM1（一種調(diào)控細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子）,。FOXM1可與反義RNA形成雙鏈，使其m6A被ALKBH5去甲基化,，這表明ALKBH5的特異性可能需要獨(dú)特的RNA結(jié)構(gòu),。總的來(lái)說(shuō),，已有的這些數(shù)據(jù)表明,，ALKBH5介導(dǎo)的m6A去甲基化對(duì)精子發(fā)育至關(guān)重要，并可能在A(yíng)LKBH5發(fā)生上調(diào)的某些疾病背景中發(fā)揮作用,。總之,，F(xiàn)TO和ALKBH5分別可使m6Am和m6A去甲基化，它們的靶標(biāo)RNA可能不是mRNA,，而是snRNA,，至少FTO的情況是如此。未來(lái)的研究應(yīng)該去探索這些酶的主要靶標(biāo)和調(diào)節(jié)這些酶以誘導(dǎo)RNA去甲基化的機(jī)制,。關(guān)于m6A是如何添加到mRNA上或從mRNA上擦除,，以及m6A是如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)的，這些問(wèn)題尚未得到完全的解答,。此外,，盡管繪制m6A圖譜是一個(gè)關(guān)鍵的進(jìn)步，但它并沒(méi)有提供關(guān)于化學(xué)計(jì)量的信息,。較新的方法,，如Mazter-Seq，將能夠精確地確定m6A在特定mRNA特定部位上的化學(xué)計(jì)量,，這也就可以確定表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組在不同細(xì)胞和疾病條件下是否確實(shí)是動(dòng)態(tài)和可變的,。使用Mazter-Seq和開(kāi)發(fā)新的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)m6A的化學(xué)計(jì)量，對(duì)于揭示是“受調(diào)控的”m6A位點(diǎn)而不是“組成型”的m6A位點(diǎn)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要,。最終,，這些研究將揭示表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組可以在多大程度上受到動(dòng)態(tài)調(diào)控以影響基因表達(dá)。了解不同的m6A writer的成分及其調(diào)控可能是研究那些受到調(diào)控的m6A位點(diǎn)性質(zhì)和功能的關(guān)鍵,。除了了解m6A的writing,，確定DF蛋白是否能被激活以誘導(dǎo)含有m6A的mRNA發(fā)生降解,、翻譯和/或定位也很重要。了解眾多新發(fā)現(xiàn)的m6A readers是否確實(shí)可識(shí)別m6A或者它們是否是DF蛋白的結(jié)合因子和潛在的調(diào)節(jié)因子也很重要,。此外,，DF蛋白是否介導(dǎo)了m6A的大部分作用或者其他途徑，這其中是否是通過(guò)m6A的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換機(jī)制,，是否又有助于m6A在生理過(guò)程中的作用,，這些都有待于闡明。最后,，精確地確定哪些腺苷殘基受到m6A eraser的控制也是很重要的,。新的數(shù)據(jù)表明FTO可對(duì)snRNA中的m6Am進(jìn)行顯著的調(diào)節(jié)，而不是對(duì)mRNA中的m6A或m6Am進(jìn)行調(diào)節(jié),。定量測(cè)量mRNA中特定位點(diǎn)的m6A水平將幫助人們深入了解哪些位點(diǎn)受到FTO或ALKBH5的調(diào)控,。
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