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酶的提取,、分離、純化及其活力測定 一,、實驗?zāi)康? 酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì),，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的,，沒有酶的催化反應(yīng),，植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分,。為要研究酶首先要將酶從組織中提取出來,，加以分離、純化,，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同,，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑,，需根據(jù)不同情況區(qū)別對待,。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性,，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向,。 二、實驗原理 （一）酶的提取 1.酶的存在位置,？ 存在于動植物以及微生物的細(xì)胞的各個部位,。 2.如何將酶從細(xì)胞中分離？ 從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題,，首先是細(xì)胞中含有許多種酶,，每種酶的濃度又很低,，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低,。此外,，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶,，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶,，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中,，提取時都應(yīng)區(qū)別對待，作不同處理,。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中,，只要將細(xì)胞破碎，酶就會轉(zhuǎn)移到提取液中,；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁,、細(xì)胞核、線粒體,、原生質(zhì)膜,、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時如僅僅破碎細(xì)胞還不夠,，還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來,。其次，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì),，如酚,，酸，離子等,，它們通常在液泡中,，當(dāng)細(xì)胞破碎時，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來,，進(jìn)入提取液中,，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基,，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強(qiáng)的氫鍵,，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離,。酚易氧化產(chǎn)生醌,，醌為一種強(qiáng)氧化劑，會使蛋白質(zhì)的功能團(tuán)發(fā)生氧化或發(fā)生聚合,，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團(tuán),，如—SH,，—NH2，通過1,，4—加成反應(yīng)而發(fā)生不可逆的聚合作用,，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生棕色,，以致影響酶活性的測定,。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗,，在這些組織中一般酚類化合物含量較低,。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液,，因為在高pH值時,，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化,，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性,，通常采用pH6.7梍7.2。已經(jīng)知道PVP能與游離酚羥基形成強(qiáng)的氫鍵復(fù)合物,，是酚類化合物的有效結(jié)合劑,。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯(lián)PVP（Polyvinyl polypyrrolidone,，簡稱PVPP,，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量,。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體,，可加10% HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和,，再用水洗幾次,，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用,。 植物細(xì)胞有堅韌的細(xì)胞壁,，需要強(qiáng)烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨,，或用玻璃勻漿器,。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱,，所用器皿和溶液需要預(yù)冷,，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率,，但工作量大,，一般寧可用量小些,，將殘渣再提取一次。提取勻漿時加入酚類結(jié)合劑PVPP,，金屬螯合劑Na2─EDTA,，以及─SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100,，以增加蛋白質(zhì)的可溶度,，常用于與膜脂結(jié)合的酶?？傊?，可以通過試驗以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件。 （二）分離和純化 1.酶的粗提液是否只有酶,，有沒有其它物質(zhì)？ 上面制備得到的提取液中,，除含有所需要的酶外,，還含有其他蛋白質(zhì)，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì),。 2.如何將酶從粗提液只分離純化,？ 要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法,，往層析法,，薄膜超濾法，親和層析法,，電泳法等,。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一,，迄今仍廣泛使用,，而且在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性，利于工作在室溫中進(jìn)行,。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低,，鹽析法就是利用這一性質(zhì)，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離,，選擇合適飽和度的硫酸銨,，使沉淀的蛋白質(zhì)的酶活性最大。大多數(shù)酶的活性存在于35梍45%和45梍55%飽和度硫酸銨沉淀的部分,，但也有存在于65梍80%飽和度的（如花椰菜根的過氧化物酶）,。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集之，再溶于少量緩沖溶液中,，經(jīng)透析或凝膠柱過濾,，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì),，然后再經(jīng)過柱層析分離。由于吸附劑的不同,，又有吸附柱層析,、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同,，分子篩類型凝膠過濾柱層析,，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了，亦即等濃度洗脫,。對于吸附柱和離子交換柱層析,，往往要采用濃度梯度溶液進(jìn)行洗脫，最方便的是線性梯度濃度,，當(dāng)然用非線性梯度會得到更好的分離效果,。柱層析一般都需要自動收集儀，如果能配用蛋白質(zhì)檢測儀就更好了,。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣,，已經(jīng)成為一種常規(guī)的酶的分離提純的步驟之一了。 近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析,。主要利用酶和底物,、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來分離,、提純酶,。首先選擇一支持物，如瓊脂糖（Sepharose）將底物,、競爭性抑制劑或輔酶,，以共價鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液,，流過裝有專一性底物,、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上,，再經(jīng)過充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì),，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競爭性洗脫,。如果親和劑選擇合適,，往往能得到較高純度的酶，是酶分離,、純化中既方便又最有效的一種方法,。 圖片：  （三）酶活力的測定 酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大,，酶的活力也越大,，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示,。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切，環(huán)境的溫度,、pH,、離子強(qiáng)度等都對酶的活力有很大的影響，因此測定酶活力時應(yīng)該使這些條件保持恒定,。 酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）μmol數(shù)表示之,。測定酶活性的方法很多，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同可選用不同的方法,，應(yīng)用最廣泛的是比色法或分光光度法,。凡反應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測定。如果酶催化的是一需氧反應(yīng),，如氧化酶,，則可用測壓法或氧電極法。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP,，如一些激酶,；或是有NAD存在，如一些脫氫酶和氧化還原酶,；或者反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶,，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測定,。總之,，測定酶活性的方法很多,，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法。 三,、材料,、儀器與試劑 要求用硫酸銨分級沉淀部分純化過氧化物酶。 （一）,、材料：花椰菜根 （二）,、儀器（儀器的選擇在實驗開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報告中提出方案后教師審定） 冰凍離心機(jī)；751型分光光度計,；電磁攪拌器,；組織搗碎機(jī)；天平,；量筒,；移液管；燒杯,；透析袋,。 （三）,、試劑（試劑的選擇在實驗開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報告中提出方案后教師審定后并配制） PVPP；硫酸銨,；0.02mol/L KH2PO4溶液,；0.lmol/L 磷酸鉀緩沖液，PH6.0,。 四,、實驗操作 (1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自來水洗凈,，吸干水分,，稱得鮮重，按每g5ml提取溶液,，加入預(yù)冷的0.02mol/L KH2PO4溶液,，加入材料鮮重10%PVPP（預(yù)先經(jīng)過純化，用蒸餾水吸脹）,。在預(yù)冷的組織搗碎機(jī)中攪成勻漿,。勻漿倒在燒杯中，于冰箱中浸提1小時,，用4層紗布或尼龍布袋過濾,，濾液于18000r/min冷凍離心15分鐘，棄去沉淀,，上清液即為酶的粗提取液,。 (2)硫酸銨分級沉淀：用量筒量得酶液的體積，吸取5ml留作酶活性及蛋白質(zhì)含量分析,，保存在冰箱中,，其余酶液加入固體硫酸銨，使達(dá)35%飽和度（參閱附表8）,，加硫酸銨時要緩慢,，以避免造成局部濃度過高，在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入,。然后置冰箱中半小時,，離心如上。分別收集上清液和沉淀,，上清液中再加入硫酸銨使達(dá)65%飽和度,，再離心，收集沉淀和上清液,。按這樣的方法分別收集0梍35%,、35梍65%、65梍80%、80梍100%飽和度硫酸銨沉淀,。每部分沉淀分別復(fù)溶于1/20原始提取液體積的0.02mol/L KH2PO4溶液中,，裝入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中進(jìn)行透析過夜,，其間更換KH2PO4溶液約4次,，直至無SO42-析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后,，分別量得適量體積,，保存于冰箱中備用。 (3)蛋白質(zhì)含量的測定：將原提取液及經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到的各分部溶液,，用Folin試劑或考瑪斯藍(lán)G—250（參閱實驗56）測定蛋白質(zhì)含量,，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。 |
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