4.1全自動DNA測序儀
4.1.1 全自動DNA測序儀的工作原理
    DNA測序是指檢測其一級結(jié)構(gòu)--核苷酸的線性排列順序,。目前DNA測序儀的工作原理主要是利用Sanger雙脫氧鏈末端終止法或Maxam-Gilbert化學(xué)降解法,。
1.雙脫氧鏈末端終止法測序原理
    是利用DNA的體外合成過程－聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。反應(yīng)體系中除加入4種dNTP外,，還加入一種 ,， -雙脫氧核苷三磷酸（ , -ddNTP，N代表A,、C,、G、T任一堿基）,。與dNTP相比,，ddNTP在脫氧核糖的 位置上缺少一個羥基，反應(yīng)過程中雖然可以與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖 -OH發(fā)生反應(yīng),，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中,，但它們本身沒有 -OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止,。據(jù)此原理分別設(shè)計四個反應(yīng)體系，每一反應(yīng)體系中存在相同的DNA模板,、引物,、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP而導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止,。由于存在ddNTP與dNTP的競爭,，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段,。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對長度不等的新生鏈進(jìn)行分離后，就可根據(jù)片段大小直接讀出新生DNA鏈的序列,。
2.新生鏈的熒光標(biāo)記原理
(1)多色熒光標(biāo)記法 多色熒光標(biāo)記法的熒光染料摻入方式有兩種,。第一種方式是將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的 端，稱為熒光標(biāo)記引物法,。第二種摻入方式是將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上,，稱為熒光標(biāo)記終止底物法。

● 表示5’端帶有不同熒光染料的引物 圖18-1 熒光標(biāo)記引物法化學(xué)原理

表示標(biāo)記不同顏色熒光染料的ddNTP 圖18-2 熒光標(biāo)記終止底物法化學(xué)原理

    此兩種方法都確定了4種熒光染料與4種雙脫氧核苷酸所終止的DNA片段之間的專一對應(yīng)關(guān)系,。兩種摻入方式的區(qū)別在于,，熒光標(biāo)記引物法使熒光有色基團(tuán)標(biāo)記在長短不同的DNA片段的 端，可以理解為熒光染料標(biāo)記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端,，且標(biāo)記發(fā)生在引物與模板的退火過程中,，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時間上有一定間隔,。而熒光標(biāo)記終止底物法使標(biāo)記和終止過程合二為一,，兩者在同一時間完成。在具體操作中,，前者要求A,、C、G,、T四個反應(yīng)分別進(jìn)行,，而后者的四種反應(yīng)可以在同一管中完成。
(3) 單色熒光標(biāo)記法 也包括熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法兩種,。與多色熒光標(biāo)記法不同的是單色熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法均需將A,、C、G,、T四個反應(yīng)分別在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行,，電泳時各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳。
3. 熒光標(biāo)記DNA的檢測原理
測序反應(yīng)產(chǎn)物加入測序儀后,，兩極間極高的電勢差推動著各個熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負(fù)極向正極泳動并達(dá)到相互分離,，且依次通過檢測窗口。由激光器發(fā)出的極細(xì)光束,，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)被導(dǎo)向檢測區(qū),，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA片段。DNA片段上的熒光發(fā)色基團(tuán)吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光,。這種代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機(jī)上同步成像,。經(jīng)計算機(jī)軟件分析后顯示測序結(jié)果。整個電泳過程結(jié)束時在檢測區(qū)某一點上采集的所有熒光信號就轉(zhuǎn)化為一個以時間為橫軸坐標(biāo)，熒光波長種類和強(qiáng)度為縱軸的信號數(shù)據(jù)的集合,。經(jīng)測序分析軟件對這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,，最后的測序結(jié)果以一種清晰直觀的圖形顯示出來。
4.1.2 全自動DNA測序儀的結(jié)構(gòu)與功能
    目前使用的全自動DNA測序儀都是通過凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行DNA片段的分離,。根據(jù)電泳方式的不同又分為平板型電泳和毛細(xì)管電泳兩種儀器類型,。平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中間,，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少,，因此又稱為超薄片層凝膠電泳。毛細(xì)管電泳技術(shù)將凝膠高分子聚合物灌制于毛細(xì)管中（內(nèi)徑50?m～100?m）,，在高壓及較低濃度膠的條件下實現(xiàn)DNA片段的快速分離,。
1.不同類型全自動DNA測序儀的外觀有所差異，但基本結(jié)構(gòu)大致相同,，主要由主機(jī),、微型計算機(jī)和各種應(yīng)用軟件等組成。
主機(jī)主要包括電泳系統(tǒng),、激光器和熒光檢測系統(tǒng)等,。大致可分為以下幾個結(jié)構(gòu)功能區(qū)：
(1)自動進(jìn)樣器區(qū) 裝載有樣品盤、電極（負(fù)極）,、電極緩沖液瓶,、洗滌液（蒸餾水）瓶和廢液管。
(2)凝膠塊區(qū) 凝膠塊區(qū)包括注射器驅(qū)動桿,、樣品盤按鈕,、注射器固定平臺、電極（正極）,、緩沖液閥,、玻璃注射器、毛細(xì)管固定螺母和廢液閥等部件,。
(3)檢測區(qū) 檢測區(qū)內(nèi)有激光檢測器窗口及窗蓋,、加熱板、毛細(xì)管,、熱敏膠帶,。
2.儀器各組成部分的功能
(1)主機(jī)功能 主機(jī)具有自動灌膠、進(jìn)樣,、電泳,、熒光檢測等功能。
自動進(jìn)樣器區(qū)功能 ①自動進(jìn)樣器受程序控制進(jìn)行三維移動,，許多操作如毛細(xì)管進(jìn)入樣品盤標(biāo)本孔中進(jìn)樣,、電極和毛細(xì)管在電極緩沖液瓶、洗滌液和廢液管中移動等均依靠自動進(jìn)樣器的移動完成；②電極為電泳的負(fù)性電極,，測序過程中,，正、負(fù)極之間的電勢差可達(dá)15000伏,，如此高的電勢差可促進(jìn)DNA分子在毛細(xì)管中很快泳動,，達(dá)到快速分離不同長度DNA片段的目的；③樣品盤有48孔和96孔兩種,，可一次性連續(xù)測試48或96個樣本,；④電極固定螺母起固定電極及毛細(xì)管的作用。
    凝膠塊區(qū)功能 ①注射器驅(qū)動桿：給注射器提供正壓力,，將注射器內(nèi)的凝膠注入毛細(xì)管中,；②樣品盤按鈕：控制自動進(jìn)樣器進(jìn)出；③注射器固定平臺：起固定注射器的作用,；④電極：為電泳的正性電極,，始終浸泡在正極緩沖液中；⑤正極緩沖液閥：當(dāng)注射器驅(qū)動桿下移,，將注射器內(nèi)的凝膠壓入毛細(xì)管時,，緩沖液閥關(guān)閉，以防止膠進(jìn)入緩沖液,；電泳時此閥打開,，提供電流通道；⑥玻璃注射器：儲存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細(xì)管時提供必要的壓力,；⑦毛細(xì)管固定螺母：固定毛細(xì)管,；⑧廢液閥：在清洗泵塊時控制廢液流。
    檢測區(qū)功能 ①激光檢測器窗口及窗蓋：從儀器內(nèi)部的氬離子激光器發(fā)出的激光可通過激光檢測器窗口照到毛細(xì)管檢測窗口上,。電泳過程中,，當(dāng)熒光標(biāo)記DNA鏈上的熒光基團(tuán)通過毛細(xì)管窗口時，受到激光的激發(fā)而產(chǎn)生特征性的熒光光譜,，熒光經(jīng)分光光柵分光后投射到CCD攝像機(jī)上同步成像,。窗蓋起固定毛細(xì)管的作用，同時可防止激光外泄,；②加熱板：電泳過程中起加熱毛細(xì)管的作用,，一般維持在50℃；③毛細(xì)管：為填充有凝膠高分子聚合物的玻璃管,，直徑為50?m,，電泳時樣品在毛細(xì)管內(nèi)從負(fù)極向正極泳動；④熱敏膠帶：將毛細(xì)管固定在加熱板上,。
(2)微型計算機(jī)功能 控制主機(jī)的運(yùn)行,，并對來自主機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。
(3)各類軟件功能 承擔(dān)數(shù)據(jù)收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能,。
4.1.3 全自動DNA測序儀的常見故障及維護(hù)
    毛細(xì)管電泳型DNA測序儀的常見故障包括電泳時儀器顯示無電流,、電極彎曲、電泳時產(chǎn)生電弧等.
(1)電泳時儀器顯示無電流 最常見的原因是由于電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低,，而未能接觸到毛細(xì)管的兩端（或一端）,。
(2)電極彎曲 主要原因是安裝、調(diào)整或清洗電極后未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令,，電極不能準(zhǔn)確插入各管中而被樣品盤打彎,。
(3)電泳時產(chǎn)生電弧 主要原因是電極、加熱板或自動進(jìn)樣器上有灰塵沉積,，此時應(yīng)立即停機(jī),，并清洗電極,、加熱板或自動進(jìn)樣器,。
(4)其它 測序結(jié)束后應(yīng)將毛細(xì)管負(fù)極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細(xì)管,。定期清洗泵塊,，定期更換電極緩沖液、洗滌液和廢液管,。
    平板電泳型DNA測序儀的常見故障包括電泳時儀器顯示無電流,、傳熱板粘住膠板及其它。
(1) 電泳時儀器顯示無電流 可能原因包括：①電泳緩沖液配制不正確,；②電極導(dǎo)線未接好或損壞,；③正極或負(fù)極鉑金絲斷裂；④正極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中,。
(2) 傳熱板粘住膠板 主要原因為上方的緩沖液室漏液,。此時應(yīng)將上方的緩沖液倒掉，并卸下緩沖液室,，松開膠板固定夾,，將傳熱板順著膠板向上滑動，直至與膠板分開,。
(3) 其它 ①倒膠前應(yīng)按照操作要求認(rèn)真清洗玻璃板,，用未清洗干凈的膠板倒膠時易產(chǎn)生氣泡、或者產(chǎn)生較高的熒光背景,；②配制凝膠時應(yīng)注意膠的濃度,、TEMED含量、尿素濃度等,，并注意防止其它物質(zhì)（尤其是熒光物質(zhì)）的污染,；③倒膠時需注意不能有氣泡，用固定夾固定膠板時，四周的力度應(yīng)均勻一致,；④將待測樣品加入各孔前,，應(yīng)使用緩沖液沖洗各孔，把尿素沖去,，以免影響電泳效果,。
4.1.4 全自動DNA測序儀的進(jìn)展
    Smith等于1986年首次建立了一種使用四種不同熒光分別標(biāo)記四種不同堿基的方法。反應(yīng)后在同一電泳管中電泳,，通過激光作用誘發(fā)熒光并檢測,。然而因不同的熒光染料有不同的電泳遷移率，使得各種染料標(biāo)記的堿基吸收光譜出現(xiàn)重疊現(xiàn)象,，增加了結(jié)果判讀的復(fù)雜性,。同年，Ansorge建立了一種使用單色熒光―四甲基羅丹明作為標(biāo)記染料的自動測序方法,。該系統(tǒng)采用激光裝置激發(fā)熒光,，并有相應(yīng)的熒光信號接收裝置，可以將熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號輸入到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中,，直接得到待測的序列數(shù)據(jù),。隨著應(yīng)用的日益廣泛，熒光標(biāo)記的自動測序系統(tǒng)也逐漸完善,。尤其是四色熒光全自動測序系統(tǒng)的發(fā)展,，進(jìn)一步提高了檢測的自動化水平。
    目前使用的全自動DNA測序儀包括平板型電泳和毛細(xì)管電泳兩種儀器類型,。平板法電泳是經(jīng)典的電泳技術(shù),，具有樣品判讀序列長（600bp～900bp）、一塊凝膠板上可同時進(jìn)行多個樣品測序（可達(dá)96個）的優(yōu)點,。毛細(xì)管電泳為近20年來建立的一種快速,、高效、進(jìn)樣量少,、靈敏度高的新技術(shù),，可測序列達(dá)到750bp左右。隨著應(yīng)用的日益廣泛,，熒光標(biāo)記的自動測序系統(tǒng)也逐漸完善,。尤其是四色熒光全自動測序系統(tǒng)的發(fā)展，進(jìn)一步提高了檢測的自動化水平,。
4.1.5 全自動DNA測序儀的主要應(yīng)用
    全自動DNA測序儀主要應(yīng)用在人類基因組測序,；人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷,；法醫(yī)的親子鑒定和個體識別,；生物工程藥物的篩選,；動植物雜交育種等方面。
4.2 蛋白質(zhì)自動測序儀
4.2.1 蛋白質(zhì)測序儀的工作原理
    蛋白質(zhì)測序儀主要檢測蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),，即肽鏈中的氨基酸序列,，其原理沿用Edman降解法。目前的蛋白質(zhì)測序儀實際上是執(zhí)行全自動化的Edman化學(xué)降解反應(yīng)和游離氨基酸的分離與鑒定過程,。
在弱堿條件下,，多肽鏈N末端NH2與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，生成PTC－多肽,。這一反應(yīng)在45℃～48℃進(jìn)行約15min并用過量的試劑使有機(jī)反應(yīng)完全,。在無水強(qiáng)酸如三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化,，肽鏈斷裂形成噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物和一個失去末端氨基酸的剩余多肽,。剩余多肽鏈可以進(jìn)行下一次以及后續(xù)的降解循環(huán)。如此不斷循環(huán),，可依次使多肽鏈的氨基酸逐一降解,，形成ATZ衍生物。ATZ衍生物經(jīng)水溶酸處理轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸（PTH氨基酸）,。
    上述降解循環(huán)的偶聯(lián)和環(huán)化發(fā)生在測序儀的反應(yīng)器（筒）中,，轉(zhuǎn)化則在轉(zhuǎn)化器進(jìn)行,。轉(zhuǎn)化后的PTH氨基酸經(jīng)自動進(jìn)樣器注入高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行在線檢測,。根據(jù)PTH氨基酸的洗滌滯流時間確定每一種氨基酸。
4.2.2 蛋白質(zhì)測序儀的結(jié)構(gòu)及其各部件的功能
(1)測序反應(yīng)系統(tǒng) 測序反應(yīng)系統(tǒng)的主要部件為反應(yīng)器,。因為反應(yīng)條件要求一定的溫度,、時間、液體流量等,，所以系統(tǒng)計算機(jī)具備調(diào)節(jié)控制這些因素,，能夠離人，甚至遙控操作,。蛋白質(zhì)或多肽在這里被水解為單個氨基酸殘基,。
(2)氨基酸分析系統(tǒng) 氨基酸分析系統(tǒng)是由十分精致的高效液相色譜毛細(xì)管層析柱組成，層析是整個測序最為關(guān)鍵的一步,，液體分配速度,、溫度、電流電壓都能影響層析結(jié)果,。所以儀器配有穩(wěn)壓,、穩(wěn)流、自動分配流速裝置,。氨基酸通過這一系統(tǒng)會留下自己的特征吸收峰,。
(3)信息軟件處理系統(tǒng) 測序軟件是根據(jù)氨基酸的層析峰來判斷為何種氨基酸,。計算機(jī)系統(tǒng)同DNA測序系統(tǒng)一樣直觀、易于操作,，它提供測序需要的運(yùn)行參數(shù),。時間，溫度,，電壓和其他的循環(huán)狀況,，并可實現(xiàn)跳躍步驟，暫停步驟,。
以上為測序儀的主要部件,，在主件之外尚有蛋白質(zhì)或多肽的純化處理配件及整個測序必備的試劑和溶液。
4.2.3 蛋白質(zhì)測序儀的主要應(yīng)用
(1)新蛋白質(zhì)的鑒定 在凝膠電泳中出現(xiàn)的未知條帶可以利用蛋白質(zhì)測序儀來測定其序列,，為探索蛋白質(zhì)的功能提供線索,，因為一些表面上不相關(guān)的蛋白質(zhì)在特定區(qū)域有時具有明顯的同源性。
(2)分子克隆探針的設(shè)計 分子克隆探針設(shè)計是蛋白質(zhì)序列信息的基本用途之一,。用蛋白質(zhì)序列信息設(shè)計PCR引物和寡核苷酸探針,。可以利用這些探針進(jìn)行cDNA文庫或基因組文庫的篩選,。
(3)抗原的人工多肽合成 在當(dāng)前的細(xì)胞生物學(xué),、遺傳學(xué)、分子生物學(xué),、免疫學(xué)及其他生命科學(xué)的研究過程中,，合成多肽已成為一個必不可少的工具。由合成多肽免疫產(chǎn)生的抗體常用來證實和純化新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì),。此外,，合成的多肽類似物能夠揭示蛋白質(zhì)重要結(jié)構(gòu)特征和提示蛋白質(zhì)的功能特性。