生物有機(jī)體的生理活動(dòng)、病理活動(dòng)以及**的功用主要是通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的,然而僅憑目前已知的蛋白質(zhì)根本無法闡明各種復(fù)雜的生命活動(dòng)過程,因此,以基因組的調(diào)研成果為基礎(chǔ),以各種先進(jìn)工藝為支撐,進(jìn)一步調(diào)研生物有機(jī)體的全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),、功能及其相互功用已經(jīng)成為必然,。目前大量工作者致力于蛋白質(zhì)組學(xué)的調(diào)研,本文現(xiàn)對(duì)此作一簡(jiǎn)述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及調(diào)研內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是調(diào)研在特定時(shí)間或環(huán)境下某個(gè)細(xì)胞或某種組織的基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì),。蛋白質(zhì)組學(xué)的真正含義在于:它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地調(diào)研某種蛋白質(zhì)分子的功能,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)工藝調(diào)研某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能,。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在列出全部蛋白質(zhì)的細(xì)目,弄清每一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互功用,對(duì)比在**和健康狀態(tài)下它們的表達(dá)水平的變化。

蛋白質(zhì)組學(xué)分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。前者利用各種先進(jìn)工藝調(diào)研蛋白質(zhì)表達(dá)的整體變化,即調(diào)研在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育,、**和死亡的不同階段中,細(xì)胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化;后者主要通過分離蛋白質(zhì)復(fù)合物系統(tǒng)地調(diào)研蛋白質(zhì)間的相互功用。

2 蛋白質(zhì)組與基因組的關(guān)系

基因是遺傳信息的攜帶者,蛋白質(zhì)則是生命活動(dòng)的執(zhí)行者,。實(shí)際上每一種生命運(yùn)動(dòng)形式,都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結(jié)果,。因而蛋白質(zhì)組調(diào)研是我們理解細(xì)胞功能和**發(fā)**展過程的中心環(huán)節(jié)。如果不能共同致力于蛋白質(zhì)組的調(diào)研,那么基因組的調(diào)研成果將無法兌現(xiàn),。

DNA序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源,而細(xì)胞的生命活動(dòng)是通過各種蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的一種動(dòng)態(tài)過程,。一個(gè)機(jī)體內(nèi)所有不同的細(xì)胞都共享同一基因組,然而同一個(gè)機(jī)體的不同細(xì)胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組,而且機(jī)體在不同發(fā)育階段,直至后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷變化。因而蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜得多,。由于對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性剪切,、**起止點(diǎn)的變化或者mRNA上三聯(lián)體密碼發(fā)生移碼突變等均可以明顯促進(jìn)蛋白質(zhì)多樣性的產(chǎn)生,而且mRNA的水平并不能反映蛋白質(zhì)水平,即使一個(gè)開放閱讀框(ORF) 呈現(xiàn)在面前,也根本無法證實(shí)某種蛋白質(zhì)存在與否。

此外,蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置,、穩(wěn)定性的變化,以及與不同的物質(zhì)如其它蛋白質(zhì),、核酸、脂類等配基相結(jié)合,再加上蛋白質(zhì)具有多種修飾形式,如糖基化,、磷酸化,、乙酰化,、硫酸化,、連接在各種載體上,如小的泛素蛋白等,所有這些均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜多個(gè)數(shù)量級(jí),同時(shí)也說明基因的存在和多樣性與蛋白質(zhì)的存在和多樣性之間是不均衡的。因此,利用基因組的調(diào)研成果進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組調(diào)研已經(jīng)成為必然,。

人類基因組測(cè)序成功為蛋白組調(diào)研奠定了良好基礎(chǔ),。例如,金黃色葡萄球菌病原體的全套基因組測(cè)序已經(jīng)完成,通過基因組的信息來調(diào)研其蛋白質(zhì)組成將有助于發(fā)現(xiàn)新的**因子、***,、工業(yè)催化劑等;1995 年流感嗜血桿菌全部基因組測(cè)序完成,為支氣管感染的調(diào)研提供了蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ),這些工作將會(huì)是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要組成部分,。

3 　蛋白質(zhì)組的調(diào)研方法

蛋白質(zhì)組調(diào)研需要有足夠的工藝支撐, 如質(zhì)譜分析(MS),酵母雙雜交系統(tǒng),蛋白質(zhì)微陣列工藝以及能夠進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件等[6 ]。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的調(diào)研可分為3個(gè)主要步驟:應(yīng)用雙向凝膠電泳,、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì);應(yīng)用氨基酸組成分析,、C2或N2末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì);應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲(chǔ)、處理,、對(duì)比和分析,。

3.1 　雙向凝膠電泳　雙向凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis , 2D 電泳)是分離蛋白質(zhì)基本的工具。其原理是:向是等電聚集電泳:用pH值呈梯度排列的凝膠,分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì),。**向是十二烷基磺酸鈉2聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PEGE):由于帶負(fù)電荷的SDS 可與蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)合,掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差別,故可分離分子量不同的蛋白質(zhì),。

雙向凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)的分離,同時(shí)也用于蛋白質(zhì)的純化,一張凝膠可分離純化出幾千個(gè)甚至上萬個(gè)蛋白質(zhì)。目前美國的roteome 公司已開發(fā)了一種全自動(dòng)化的儀器,灌腔,、電泳,、染色全部實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。雙向凝膠電泳工藝存在的問題是不易分離極酸或極堿、( > 200kD) 或極小( < 10kD) 的蛋白質(zhì),不易檢測(cè)低拷貝( < 1000 拷貝) 蛋白質(zhì)或難溶解蛋白質(zhì),。

此外,還有三種新的方法可以用作對(duì)22D 電泳的補(bǔ)充:帶有同位素的親和性標(biāo)簽標(biāo)記法,二維液相色譜2串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)量法,毛細(xì)管區(qū)帶電泳,。

3.2 “雙向”高效柱層析　“雙向”高效柱層析原理:向用分子篩柱層析,按蛋白質(zhì)不同分子量進(jìn)行分離;**向用反向柱層析,利用蛋白質(zhì)表面疏水性質(zhì)進(jìn)行分離。**向的分離原理與雙向凝膠電泳中利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離不同,因此兩種方法可相互補(bǔ)充,。

雙向高效柱層析的優(yōu)點(diǎn): (1) 可分離得到較多的蛋白量以供鑒定; (2) 可與質(zhì)譜分析聯(lián)用,分離流出的蛋白峰直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定,。

3.3 氨基酸組成分析　氨基酸組成分析可提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。原理是用酸水解蛋白質(zhì),測(cè)定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)( %) 或各氨基酸的摩爾比率,與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的理論值進(jìn)行比較,。氨基酸組成分析經(jīng)濟(jì),、快速,但靈敏度低。

3.4 　C或N 端氨基酸序列分析　N2端氨基酸序列分析常用Edman 降解法測(cè)定蛋白質(zhì)N端氨基酸序列,C2端氨基酸序列分析常用羧肽酶法,、化學(xué)降解法測(cè)定蛋白質(zhì)C 端氨基酸序列,。目前均可用自動(dòng)測(cè)序儀。N 端4 個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定43 %～83 %蛋白質(zhì),、C端5 個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定74 %～97%蛋白質(zhì),若兩者結(jié)合使用,判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)更高,。

3.5 　質(zhì)譜分析　以往MS 僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析,由于新的離子化工藝的出現(xiàn),如:介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化,各種新的質(zhì)譜工藝開始用于生物大分子的分析,。其原理是:通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子,然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng),、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值__(M/

Z值) 的蛋白質(zhì)離子分離開來,經(jīng)過離子檢測(cè)器收集分離的離子,確定離子的M/ Z值,分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜工藝主要用于檢測(cè)雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量,也可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互功用等方面的調(diào)研,。三條肽段的質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì),。

近年來,串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛,其數(shù)據(jù)采集方面的自動(dòng)化程度、檢測(cè)的敏感性及效率都大大提高,大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測(cè)序工作,。目前,利用22D 電泳及MS工藝對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析,已經(jīng)鑒定出1 484 種蛋白質(zhì),包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì),。

3.6 酵母雙雜交系統(tǒng)　對(duì)于調(diào)研蛋白質(zhì)間的相互功用,酵母雙雜交系統(tǒng)是非常有力的工具。其基本原理是:由于所有真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子都由兩部分獨(dú)立的功能域組成,即DNA結(jié)合功能域(DNA2BD)和激活功能域(AD) ,。DNA2BD 的功用是與特異的啟動(dòng)子結(jié)合,AD 的功用是引導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合物,兩者靠近并協(xié)同功用,才能使DNA 結(jié)合位點(diǎn)下游的基因得以轉(zhuǎn)錄,。如果將待測(cè)蛋白之一與DNA2BD融合,蛋白之二與AD 融合,若待測(cè)的兩種蛋白有相互功用,則DNA2BD 和AD靠近并激活報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄,借此可調(diào)研蛋白質(zhì)間的相互功用。

為了大規(guī)模高通量調(diào)研蛋白間的相互功用,近年來發(fā)展了一種酵母雙雜交掃描法,。建立兩類含不同cDNA文庫的酵母菌株,在類菌株中,讀碼框(ORF) 以DNA2BD 融合蛋白形成被表達(dá),在**類菌株中,ORF以AD 融合蛋白形式被表達(dá),將兩類菌株配對(duì),用缺陷的培養(yǎng)基篩選二倍體,只有表達(dá)兩種可以相互功用的蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞才可以在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng),。

該方法的應(yīng)用模式有兩種:一種是微陣列模式,即先將類酵母菌(表達(dá)已知蛋白- DNA2BD 融合蛋白)克隆在陣列的柵狀網(wǎng)孔內(nèi),以此篩查**類菌株(表達(dá)待測(cè)蛋白2AD 融合蛋白),從而確定待測(cè)蛋白質(zhì)可與哪一已知蛋白質(zhì)相結(jié)合;另一種是庫篩查模式,即先將一組ORF產(chǎn)生的融合蛋白建成一個(gè)庫,而后通過待測(cè)蛋白質(zhì)與庫中的蛋白質(zhì)的反應(yīng)尋找可以相互功用某個(gè)或某些蛋白質(zhì)。

近,從酵母雙雜交系統(tǒng)衍生出一種新的方法,稱為“反向雙雜交”,主要用于鑒定可以干擾蛋白質(zhì)間相互功用的化合物和多肽,。與傳統(tǒng)方式不同,這種方法可以用于開發(fā)在體內(nèi)具有活性的**,。

此外,酵母雙雜交系統(tǒng)的功用已經(jīng)擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定,通過這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與酵母菌mRNA 剪接相關(guān)的15種蛋白質(zhì),以及噬菌體T7 的55 種蛋白質(zhì)、痘苗病毒的226 種蛋白質(zhì),、釀酒酵母的5 345種蛋白質(zhì),。酵母雙雜交系統(tǒng)提供的蛋白質(zhì)間可能的相互功用的信息,還需通過進(jìn)一步的生物化學(xué)試驗(yàn)加以確定和排除。

3.7 　微陣列工藝　嚴(yán)格的講,DNA微陣列工藝并非蛋白質(zhì)組工藝的范疇,但是卻不失為大規(guī)模調(diào)研蛋白質(zhì)功能的一種好方法,。通常在轉(zhuǎn)錄中受到協(xié)同調(diào)控的基因?qū)⒕幋a同種功能的蛋白質(zhì),如果某一段DNA 序列與已知功能的DNA序列在很大程度上相同,說明它們編碼的蛋白質(zhì)的功能也可能相同,例如酵母細(xì)胞中與細(xì)胞分裂周期和芽孢形成相關(guān)的基因可能編碼功能相同的蛋白質(zhì)[13 ] ,。蛋白質(zhì)陣列工藝已經(jīng)發(fā)展起來,蛋白質(zhì)樣品以納升小滴共價(jià)吸附在玻璃,、硅、塑料等載物片上,每一個(gè)載物片可以點(diǎn)1 000個(gè)樣品,可用于鑒定一個(gè)生物有機(jī)體的全部修飾酶[14 ],。例如:蛋白質(zhì)微陣列工藝已經(jīng)檢測(cè)出酵母中近乎全套的蛋白激酶[15 ] ,。

3.8 生物信息學(xué)　蛋白質(zhì)組的調(diào)研要求有自動(dòng)化處理大規(guī)模數(shù)據(jù)的工具,從而促使生物信息學(xué)迅速發(fā)展。目前許多與蛋白質(zhì)組相關(guān)的軟件可通過與EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器鏈接而獲得,這些軟件可用于鑒定蛋白質(zhì)的種類,分析蛋白質(zhì)的理化特性,預(yù)測(cè)可能的**后修飾以及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),其中注釋蛋白質(zhì)和二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組調(diào)研的生物信息學(xué)核心,。

4 　蛋白質(zhì)組學(xué)與**

蛋白質(zhì)組學(xué)可以讓我們對(duì)人類**的發(fā)病機(jī)制有更加清楚的認(rèn)識(shí),。在基因水平檢測(cè)基因的突變和多態(tài)性,在蛋白質(zhì)水平分析健康及病變組織不同水平的基因表達(dá),對(duì)于**的發(fā)病機(jī)制的調(diào)研二者均具有重要意義,但對(duì)于**的診斷**方面后者更為重要。

正常及患病個(gè)體的組織,、體液中的蛋白質(zhì)分布、特征及差異都是將蛋白質(zhì)組學(xué)工藝應(yīng)用于分子診斷學(xué)的基礎(chǔ),。例如:骨髓瘤患者尿液中沉淀物-Bence2Jones 蛋白,、抗上皮細(xì)胞腫瘤特異性抗體、病變肝細(xì)胞中的p53蛋白均可以作為腫瘤的標(biāo)記,用于腫瘤的診斷,。目前,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)工藝已發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關(guān)的異常糖基化的蛋白質(zhì),但將這些調(diào)研結(jié)果應(yīng)用于臨床診斷其價(jià)值尚待評(píng)估,。

到目前為止,心功能障礙的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。如果用蛋白質(zhì)組學(xué)的調(diào)研方法分析心肌蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,將為闡明心臟**相關(guān)的細(xì)胞病變機(jī)制提供新的思路,也將有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記,、**方法,。人類心臟蛋白質(zhì)聯(lián)合二維電泳數(shù)據(jù)庫已建立,目前已鑒定幾百種心臟蛋白質(zhì)。

對(duì)于感染性**而言,由于許多微生物的部分或全部基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成,這將有助于鑒定該微生物所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì),以尋找新的診斷標(biāo)記,尋找用作疫苗的抗原及毒力決定簇等,。

5 　蛋白質(zhì)組與**開發(fā)

**功用的靶標(biāo)多為蛋白質(zhì),。如何發(fā)現(xiàn)更多的**功用的靶蛋白是藥品開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組調(diào)研能發(fā)現(xiàn)那些在健康人組織細(xì)胞中正常表達(dá)或不存在,而在患者組織細(xì)胞中異常表達(dá)或出現(xiàn)的蛋白質(zhì),為藥品開發(fā)提供新的**靶標(biāo),或新的生物標(biāo)記,還能發(fā)現(xiàn)與**毒性相關(guān)的蛋白質(zhì),用于預(yù)報(bào)**的毒副功用,從而減少到臨床試驗(yàn)階段才發(fā)現(xiàn)該**的副功用所造成的中間階段的損耗,。除了**功用的靶蛋白的選擇外,觀察**對(duì)靶蛋白的功用及**毒性的調(diào)研也同樣重要,。在這一調(diào)研領(lǐng)域中,可采用CD2標(biāo)記(CD2tagging)工藝調(diào)研用藥期間蛋白質(zhì)組中的任一成員在分子和細(xì)胞水平的各種變化。其原理是將帶有CD2tagging 的CD盒插入某一個(gè)表達(dá)基因的內(nèi)含子,結(jié)果該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA增加了一段外來序列,該基因編碼的蛋白質(zhì)增加了一個(gè)特殊的外來肽———抗原決定簇或熒光蛋白,這種外來肽作為標(biāo)記物,可用高效價(jià)的抗體識(shí)別或各種熒光檢測(cè)方法觀察,標(biāo)記的基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化可用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR) ,、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT2PCR),、測(cè)序等方法觀察。因此,CD2標(biāo)記工藝可用來調(diào)研基因的轉(zhuǎn)錄,、**水平的變化,評(píng)估基因的功能狀態(tài),探查蛋白質(zhì)表達(dá)的組織特異性,以及蛋白質(zhì)在細(xì)胞或細(xì)胞器中的定位,等等,。該項(xiàng)工藝的特點(diǎn)是:

(1)尤其適用于標(biāo)記內(nèi)含子豐富的基因; (2) 被標(biāo)記的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白質(zhì)均保留正常的功能; (3)不影響基因的正常調(diào)控; (4) 可在組織細(xì)胞原位觀察調(diào)研標(biāo)記基因,、標(biāo)記蛋白;(5)也可從組織細(xì)胞中分離提純標(biāo)記蛋白,然后用于生化,、功能檢查。

蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ正日漸走向成熟,。相信對(duì)于未來醫(yī)學(xué)的發(fā)展,無論是基礎(chǔ),、臨床調(diào)研,還是**開發(fā),蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ的貢獻(xiàn)都將不可估量。