第五節(jié)   核酸代謝

 （一）,、一般性質(zhì)

1．溶解度

   DNA和RNA均微溶于水，它們的鈉鹽在水中的溶解度較大．DNA和RNA均能溶于2-甲氧乙醇,，但不溶于乙醇,、乙醚等有機溶劑，所以在分離核酸時,，加入乙醇即可使之從溶液中沉淀出來,。

2．分子大小,、形狀和粘度

    大多數(shù)DNA為線形分子,，分子極不對稱，其長度可以達到幾個厘米,，而分子的直徑只有2nm,。因此DNA溶液的粘度極高。RNA溶液的粘度要小得多,。

    3．沉降特性

    溶液中的核酸分子在引力場中可以下沉,。不同構(gòu)象的核酸（線形、開環(huán),、超螺旋結(jié)構(gòu)）,，蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)，在超離心機的強大引力場中,，沉降的速率有很大差異,，所以可以用超離心法純化核酸或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸進行分離，也可以測定核酸的沉降常數(shù)與分子量,。

    用不同介質(zhì)組成密度梯度進行超離心分離核酸時,，效果較好。RNA分離常用蔗糖梯度,。分離DNA時用得最多的是氯化銫梯度,。氯化銫在水中有很大溶解度，可以制成濃度很高（80mol／L）的溶液。

    應用啡淀嗅紅一氯化銫密度梯度平衡超離心,，很容易將不同構(gòu)象的DNA,、RNA及蛋白質(zhì)分開,。這個方法是目前實驗室中純化質(zhì)粒DNA時最常用的方法,。如果應用垂直轉(zhuǎn)頭，每分鐘65 000r（Beckman L-70超離心機）,，只要6h就可以完成分離工作,。但是如果采用角轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速為每分鐘45 000r時,，則需36h,。離心完畢后,，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚（如圖4-10）,。蛋白質(zhì)漂浮在最上面，RNA沉淀在底部,。超螺旋DNA沉降較快，開環(huán)及線形DNA沉降較慢,。用注射針頭從離心管側(cè)面在超螺旋DNA區(qū)帶部位刺入,，收集這一區(qū)帶的DNA,。用異戊醇抽提收集到的DNA以除去染料,，然后透析除去CsCl，再用苯酚抽提1～2次,，即可用乙醇將DNA沉淀出來,。這樣得到的DNA有很高的純度,，可供DNA重組、測定序列及限制酶圖譜等之用。在少數(shù)情況下,，需要特別純的DNA時,，可以將此DNA樣品再進行一次氯化銫密度梯度超離心分離。

圖4-10 經(jīng)染料?氯化銫密度超離心后,，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布

（二）,、凝膠電泳

凝膠電泳可算是當前核酸研究中最常用的方法了。它有簡單,、快速,、靈敏、成本低等優(yōu)點,。常用的凝膠電泳有瓊脂糖（agarose）凝膠電泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠電泳,。凝膠電泳可以在水平或垂直的電泳槽中進行,。凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重效果,，所以分離效率很高,。

    1．瓊脂糖凝膠電泳

    以瓊脂糖為支持物，電泳的遷移率決定于以下因素：

    （1）核酸分子大小  遷移率與分子量對數(shù)成反比,；

    （2）膠濃度  遷移率與膠濃度成反比,，常用1％的膠分離DNA,；

    （3）DNA的構(gòu)象  一般條件下超螺旋DNA的遷移率最快,，線形DNA其次,，開環(huán)形最慢,。但在膠中加入過多的啡啶溴紅時，上述分布次序會發(fā)生改變,；

    （4）電流  一般不大于5V/cm。有適當?shù)碾妷翰顣r,，遷移率與電流大小成正比,；

    （5）堿基組成  有一定影響,，但影響不大,；

    （6）溫度  4～30℃都可，常為室溫,。

    瓊脂糖凝膠電泳常用于分析DNA。由于瓊脂糖制品中往往帶有核糖核酸酶雜質(zhì),，因此用于分析RNA時,，必須加入蛋白質(zhì)變性劑,，如甲醛等,。圖4-10為分離后DNA與各種雜質(zhì)的分布,。

電泳完畢后,，將膠在熒光染料啡啶溴紅的水溶液中染色（0.5μg／ml）。啡啶溴紅為一扁平分子,，很易插入DNA的堿基對之間。DNA與啡啶溴紅結(jié)合后,，經(jīng)紫外光照射,，可發(fā)射出紅—橙色可見熒光。0.1μgDNA即可用此法檢出,，所以此法十分靈敏,。根據(jù)熒光強度可以大體判斷DNA樣品的濃度。若在同一膠上加一已知其濃度的DNA作參考,，則所測得的樣品濃度更為準確,。可以用靈敏度很高的負片將凝膠上所呈現(xiàn)的電泳圖譜在紫外光照射下拍攝下來,，作進一步分析與長期保留之用,。

應用凝膠電泳可以正確地測定DNA片段的分子大小。實用的方法是在同一膠上加一已知相對分子質(zhì)量的樣品（如圖4-11中的λDNA／HindIII的片段）,。電泳完畢后,，經(jīng)啡啶溴紅染色、照相,，從照片上比較待測樣品中的DNA片段與標準作品中的哪一條帶最接近,，即可推算出未知樣品中各片段的大小。最常用的方法是將膠上某一區(qū)帶在紫外光照射下切割下來,，將切下的膠條放在透析袋中,，裝上電泳液,，在水平電泳槽中進行電泳，讓膠上的DNA釋放出來并進一步粘在透析袋內(nèi)壁上,，電泳3～4h后,，將電極倒轉(zhuǎn)，再通電30～60s,，粘在壁上的DNA重又釋放到緩沖液中,。取出透析袋內(nèi)的緩沖液（丟棄膠條），用苯酚抽提1～2次,，水相用乙醇沉淀,。這樣回收的DNA純度很高，可供進一步進行限制酶分析,、序列分析或作末端標記,。回收率在50％以上,。

2．聚丙烯酸胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺作支持物,。單體丙烯酰胺在加入交聯(lián)劑后就成了聚丙烯酰胺。由于這種凝膠的孔徑比瓊脂糖膠的要小,，所以可用于分析小于1000bp的DNA片段,。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA的分析,。

    聚丙烯酰胺凝膠上的核酸樣品,，經(jīng)啡啶溴紅染色，在紫外光照射下,，發(fā)出的熒光很弱,，所以濃度很低的核酸樣品用此法檢測不出來。

（三）,、核酸的紫外吸收

嘌呤堿與嘧啶堿具有共軛雙鍵,，使堿基、核苷,、核苷酸和核酸在240～290 nm的紫外波段有一強烈的吸收峰,，最大吸收值在260 nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性,。所以可以用紫外分光光度計加以定量及定性測定,。

實驗室中最常用的是定量測定少量的DNA或RNA。檢驗待測樣品是否純品可用紫外分光光度計讀出260 nm與280 nm的OD值,，從OD₂₆₀／OD₂₈₀的值即可判斷樣品的比純度,。純DNA的OD₂₆₀／OD₂₈₀應為1.8，純RNA的應為2.0,。樣品中如含有雜蛋白及苯酚,，OD₂₆₀／OD₂₈₀的值即明顯降低,。不純的樣品不能用紫外吸收法作定時測定。對于純的樣品,，只要讀出260nm的OD值即可算出含量,。通常按1OD值相當于50μg／ml

雙螺旋DNA，或40μg／ml單螺旋DNA（或RNA）,，或2μg／ml寡核苷酸計算,。這個方法既快速又準

確，而且不會浪費樣品,。對于不純的核酸可以用瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶后,，經(jīng)啡啶溴紅染色而粗略地估計其含量。圖4-12為DNA的紫外吸收光譜,。

圖4-12  DNA的紫外吸收光譜      1.天然DNA,；2.變性DNA；3.核苷酸總吸收

（四）,、核酸的變性,、復性和分子雜交

    1、核酸的變性,、復性

高溫,、酸、堿以及某些變性劑（如尿素）能破壞核酸中的氫鍵,，使之斷裂,，核酸中的雙螺旋區(qū)變成單鏈，并不涉及共價鍵的斷裂,，這一過程稱為核酸的變性。

當將DNA的稀鹽溶液加熱到80～l00℃時,，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體,，兩條鏈分開，形成無規(guī)線團（如圖4-13）, 一系列理化性質(zhì)也隨之發(fā)生改變：260 nm區(qū)紫外吸收值升高,，粘度降低,，浮力密度升高，同時改變二級結(jié)構(gòu),，有時可以失去部分或全部生物活性,。DNA的變性的特點是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi),。

圖4-13  DNA的變性過程

通常把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度（meltingtemperature）,，用T_m表示。DNA的T_m值一般在70～85℃之間,。如圖4-14,。      

DNA的T_m值大小與下列因素有關(guān)：

　?。ǎ保?/span>DNA的均一性　均一性愈高的樣品，熔解過程愈是發(fā)生在一個很小的溫度范圍內(nèi),。

（２）G—C之含量  G—C含量越高,，T_m值越高，成正比關(guān)系,，如圖4-15,。這是G—C對比A—-T對更為穩(wěn)定的緣故。所以測定T_m值可推算出G—C對的含量,。其經(jīng)驗公式為：

G—C（％）＝（T_m－69.3）×2.44  

（３）介質(zhì)中的離子強度一般說來,，在離子強度較低的介質(zhì)中，DNA的熔解溫度較低,，熔解溫度的范圍也較窄,。而在較高的離子強度的介質(zhì)中，情況則相反,。所以DNA制品應保存在較高濃度的緩沖液中或溶液中,，故常在1 mol／L的NaCl中保存。

    RNA分子中有局部的雙螺旋區(qū),，所以RNA也可發(fā)生變性,，但T_m值較低，變性曲線也不那么陡,。

    變性DNA在適當條件下,，又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復性,。DNA復性后,，許多物理化學性質(zhì)又得到恢復，生物活性也可以得到部分恢復,。

    將不同來源的DNA放在試管里,，經(jīng)熱變性后，慢慢冷卻,，讓其復性,，若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則復性時,，會形成雜交DNA分子,。DNA與互補的RNA之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學和分子遺傳學的研究中應用極廣,，許多重大的分子遺傳學問題都是用分子雜交來解決的,。

    核酸雜交可以在液相或固相上進行。目前實驗室中應用最廣的是用硝酸纖維素膜作支持物進行的雜交,。英國的分子生物學家E. M .Southern所發(fā)明的Southern印跡法（Sonthern

blotting）就是將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后,，再進行雜交的,。這里以DNA-DNA雜交為例，較詳細地介紹Southern印跡法,。將DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解后,，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離。將膠浸泡在堿（NaOH）中使DNA進行變性,，然后將變性DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（硝酸纖維素膜只吸附變性DNA?。?/span>80℃烤4～6h,，使DNA牢固地吸在纖維素膜上,。然后與放射性同位素標記的變性后的DNA，探針進行雜交,。雜交須在較高的鹽濃度及適當?shù)臏囟龋ㄒ话銥?/span>68℃）下進行數(shù)小時或十余小時,，然后通過洗滌除去未雜交上的標記物。將纖維素膜烘干后進行放射自顯影,。

    除了DNA外,，RNA也可用作探針（Probe）。用³²P標記核酸時（用作探針）,，可以在3′或 5′末端標記,，也可采用均勻標記。

    應用類似的方法也可分析RNA,，即將RNA變性后轉(zhuǎn)移到纖維素膜上再進行雜交,。這種方法稱為Northern印跡法（Northern blotting）。用類似的方法,，根據(jù)抗體與抗原可以結(jié)合的原理,，也可以分析蛋白質(zhì)。這個方法稱為Western印跡法（Western blotting）,。

    應用核酸雜交技術(shù),，可以將含量極少的真核細胞基因組中的單拷貝基因釣出來。

  （五）,、核酸的分離

    1． RNA的分離

    RNA的分離方法因材料及所要分離的RNA種類而異。目前最普遍使用的是酚提取法,。將組織勻漿用苯酚處理并離心,，RNA即溶解于上層被苯酚飽和的水層中，而DNA和已被凝固的蛋白質(zhì)分布在下層為水飽和的苯酚中,。將上清液吸出,，加入乙醇，RNA即呈白色絮狀沉淀析出,。

    2．DNA的分離

    DNA的提取法也有多種,。目前一般是根據(jù)DNA核蛋白能溶于水及高濃度(1～2 mol／L)NaCl溶液,，而難溶于0.14 mol／L的 NaCl，RNA核蛋白則易溶于0.14 mol／L的NaCl溶液這一原理進行分離,?？上扔?/span>0.14 mol／L的NaCl溶液除去組織中的RNA核蛋白，然后用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,，SDS）處理,，使DNA與蛋白質(zhì)分離，并用濃（1 mol／L）NaCl溶液溶解DNA,，再用氯仿—異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去,，最后向DNA溶液中加入乙醇，DNA即呈絲狀物沉淀析出,。