一,、引物設(shè)計(jì)原則

聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法,，故又稱基因的體外擴(kuò)增法,。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用最多，最廣泛的手段之一,，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán),，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶）,，不出帶或出帶很弱,，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行,，可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁,，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件,。引物設(shè)計(jì)原則如下：

1,、引物應(yīng)在序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并具有特異性。引物序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū),，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列,。這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性,；

2,、引物的長度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp,，但不應(yīng)大于38,，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng),；

3,、引物不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行,；

4、引物序列的GC含量一般為40-60%。過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),。上下游引物的GC含量不能相差太大,；

5、引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳,。Tm值的計(jì)算有多種方法,，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；

6,、引物5'端序列對PCR影響不太大,，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物?？筛鶕?jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定,。

7、引物3’端不可修飾,。引物3'端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響,。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基,，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A,。

8、引物序列自身或者引物之間不能在出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基,，如GGG或CCC,，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加；

9,、G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端 G值較低（絕對值不超過9）,，而5’端和中間 G值相對較高的引物,。引物的3’端的 G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng),；

值得一提的是,，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難,，例如GC含量偏高或偏低,，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定,，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低,，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件,。

二,、引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0及oligo6.0

“Premier”的主要功能分四大塊,，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì),、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA 基元(motif)查找,。“Premier”還具有同源性分析功能,，但并非其特長，在此略過,。此外,，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡并引物,，另外還有序列“朗讀”,、DNA 與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等,。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA 來設(shè)計(jì)引物,，由于大多數(shù)氨基酸（20 種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此,，由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí),，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物,，它們的序列組成大部分相同,，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡并引物,。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異,，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的?！癙remier”可以針對模板DNA 的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列,。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）,、無脊椎動(dòng)物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）,、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）,、原生動(dòng)物線粒體（Protozoan Mitochondrion）,、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）、脊椎動(dòng)物線粒體（Vertebrate Mito-chondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）,。

對引物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的的軟件中,，“oligo” 是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜,，Oligo 6.0的界面是三個(gè)圖,，Tm圖、ΔG圖和Frq圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一,，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界,。所以引物設(shè)計(jì)的最佳搭配是“Premier”進(jìn)行引物搜索“Oligo” 對引物分析評(píng)價(jià),。

三、設(shè)計(jì)步驟

A,、引物搜索

1,、打開Primer premier5.0軟件，調(diào)入人瘦素 (leptin) 基因序列：點(diǎn)擊“file” “open” “DNA sequence”,；或者直接點(diǎn)擊“file” “new” “DNA sequence”,，彈出一對話框如下圖，然后將序列人瘦素 (leptin) 基因復(fù)制在空白框,。

2,、序列文件顯示如圖，點(diǎn)擊“Primer”,；

3,、進(jìn)一步點(diǎn)擊“search” 按鈕，出現(xiàn)“search criteria”窗口,，有多種參數(shù)可以調(diào)整,。搜索目的（Seach For）有三種選項(xiàng)，PCR引物（PCR Primers）,，測序引物（Sequencing Primers）,，雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上,、下游引物（Sense/Anti-sense Primer,，或Both），或者成對查找（Pairs）,，或者分別以適合上,、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges）,，引物長度（Primer Length）,，選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等,。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù),。我們將Product Size設(shè)置300－350，其他參數(shù)使用默認(rèn)值,。

然后點(diǎn)擊“OK” ,，隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search Completed時(shí),，再點(diǎn)擊“OK”。

4,、這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn),，有三種顯示方式，上游引物（Sense）,，下游引物(Anti-sense),，成對顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對方式,，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列,，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)（如下圖）,。

5、按照搜尋結(jié)果顯示,，在主窗口中檢查該引物對的二級(jí)結(jié)構(gòu)情況,，逐條分析，依次篩選,。下面進(jìn)行序列篩選：點(diǎn)擊其中一對引物,，如第21#引物，在“Peimer Premier”主窗口,，如圖所示：該圖分三部分,，最上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì),，最下面是四種重要指標(biāo)的分析,，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer）,，錯(cuò)誤引發(fā)情況（False Priming）,，及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí),，按鈕由“None” 變成“Found” ,，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況,。一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu),，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有“Found”，只有“None” ,。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度,，可參考應(yīng)用。

B,、引物分析

1,、打開oligo的頁面如下：

2,、單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl＋O”可彈出一對話框，然后選擇序列人瘦素 (leptin) 基因,。出現(xiàn)以下窗口,。

3、點(diǎn)擊“window”再點(diǎn)擊“Tile”,，出現(xiàn)以下窗口,，圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、ΔG和Frq,，因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo),，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式,。如果覺得太擁擠,，可去掉一個(gè)指標(biāo)。
G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度,，最好引物的?G值在5’端和中間值比較高,，而在3’端相對低（如圖）。Tm值曲線以選取72℃附近為佳,，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng),。Frq曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小,。選取引物時(shí),，宜選用3’端Frq值相對較低的片段。

4,、在設(shè)計(jì)時(shí),，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適,，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕 ,，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成紅色,，表示上游引物已選取好,。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower,。

5,、當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對引物進(jìn)行評(píng)價(jià),?？梢杂谩癆nalyse”菜單分析你的引物：比如有無引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等,。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性,。需要注意的是,，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）,。二聚體形成的能值越高,，越不符合要求。一般的檢測（非克?。┬訮CR,，對引物位置、產(chǎn)物大小要求較低,，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物,。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好,。一般來說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好,。當(dāng)然,，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn),，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低,。這種PCR需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果,，對引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量,，以45-55％為宜,。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi),，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,，以有利于退火溫度的選擇。

當(dāng)我們結(jié)束以上三項(xiàng)檢測,，按Alt+P鍵彈出PCR窗口,，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小,、Tm值等參數(shù),，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評(píng)價(jià)。