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有趣的糖科學史

唾液酸的發(fā)現(xiàn)史（之一）

“

燕巢雖小,，心懷天下；

人居其室,，內(nèi)有乾坤,。

”

“層出不窮”唾液酸

在1973年第二屆國際糖復合物研討會上，阿爾弗雷德·戈特沙爾克（Alfred Gottschalk）應邀討論了糖蛋白研究的現(xiàn)狀,，他說：“我們尚未走到盡頭,，一切僅僅剛剛開始，我們只是到達了一片未知大陸的海岸有待登陸,?！边@些話可能恰巧最適用于他畢生喜愛的課題：關于唾液酸（sialic acid）的相關研究。戈特沙爾克鼓勵對科學研究感興趣的學生從事糖生物學領域的工作,，而這一領域在 20世紀70年代得以迅速發(fā)展,。自彼時以降，許多關于唾液酸的化學,、分析,、生物化學和生物學的問題都得到了解答，這一糖分子家族對我們生活的重要影響,，也已廣泛出現(xiàn)在大量的學術出版物中,。

唾液酸在自然界中以多種分子形式存在，自20世紀60年代以來已有各種詳細的描述,。這些化合物通常存在于高等動物中,，如棘皮動物門、半索動物門,、頭索動物門和脊椎動物門,，偶爾也可以在其他動物類群的一些成員中發(fā)現(xiàn)，如頭足綱,、扁形動物門中的渦蟲和甲殼綱中的螯龍蝦,。唾液酸還存在于某些病毒、各種細菌,、原生動物和致病真菌中,。它們不存在于植物和進化樹中低于棘皮動物門的大多數(shù)動物中。各種研究表明,，唾液酸在進化過程中出現(xiàn)得相對較晚,，這導致人們假設獲得這些單糖會加速高等動物的分化。在天然存在的含唾液酸結構中,，唾液酸單元通過碳水化合物-蛋白質(zhì)相互作用在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,，包括細胞識別和通訊、細胞聚集和發(fā)育,、控制生物體中糖復合物的壽命,、介導細菌和病毒感染,、參與腫瘤生長和轉移、在免疫學,、微生物組生物學,、細胞信號傳遞、生殖生物學和神經(jīng)生物學中發(fā)揮了重要作用,。唾液酸主要存在于許多糖復合物（糖蛋白,；糖脂）和碳水化合物鏈（寡糖、莢膜和組織多聚唾液酸,、細菌脂寡糖/多糖）的末端,，并且以各種化學形式存在（圖1）。它實際上是更為古老的α-酮酸（α-keto acid）單糖家族的一個子集,，該家族具有九碳骨架,，被稱為壬酮糖酸(nonulosonic acid, NulO)，在一些真細菌和古菌中也有發(fā)現(xiàn)（圖2）,。本期及余下的幾期中,，我們將抽絲剝繭，回顧這些糖生物學中令人著迷的分子,，以及它的發(fā)現(xiàn)史,。

圖1 唾液酸的復雜性具有不同的層級結構。唾液酸組的復雜程度至少存在著以下幾個層級 (A)唾液酸核心及核心修飾：與各種基團的酯化,，O-甲基化,，內(nèi)酯化或內(nèi)酰胺化，產(chǎn)生逾80種不同的結構; (B)與表層下的糖之間的,、不同的連鍵類型,。包括四種主要連鍵類型和許多次要連鍵類型; (C)表層下糖鏈的特性和排列，還可以通過巖藻糖基化或硫酸化獲得進一步的修飾,；(D)聚糖類別的不同(N-連接或O-連接的糖蛋白，鞘糖脂),；(E) 唾液酸在唾液酸化微域中的空間組織,，即被稱為 "簇狀糖斑 "或 "糖突觸 "的唾液酸化微域。

圖2 唾液酸和其他壬酮糖酸,。如圖所見,，唾液酸是壬酮糖酸的一個子集。

埃爾利希,，比亞爾與一盆滋味

距今140多年前的1877年,，德國科學家菲利克斯·霍普-塞勒(Felix Hoppe-Seyler)描述了一種物質(zhì)，它是經(jīng)過高溫弱酸處理后從上皮粘蛋白中釋放出來的一種酸性化合物,，酸性強于碳酸,。在堿性條件下加熱時溶液可變成棕色,。該化合物含有氮元素，可還原氧化銅,、氧化鉍或硫酸靛藍,，但無法被啤酒酵母發(fā)酵。如何純化這一物質(zhì)是長期困擾科學家的問題之一,。除了霍普-塞勒外,，格林（J.R.Green）、克魯根博格（C. Fr. W. Krukenberg）和澤勒（H.Zeller）在研究亞洲金絲燕時觀察到了類似的弱酸性物質(zhì),，這些鳥類使用它們的唾液腺分泌黏蛋白來筑巢,。燕窩可以食用，并有一定的營養(yǎng)和藥用價值,。

“有趣的是,，格林聲稱從釋放的物質(zhì)中觀察到了糖的結晶，而澤勒卻無法佐證這一說法：“顯然,，格林認為所觀測到的無機物質(zhì)其實就是糖”,。

風趣的是，多年之后,，從燕窩中的黏蛋白反而成為了分離克級唾液酸的絕佳來源,，因為研究者只需將磨碎的燕窩在回流狀態(tài)下下煮沸5個小時即可獲得大量的唾液酸。

時間來到1898年,，德國的保羅·埃利希（Paul Ehrlich）發(fā)現(xiàn)將這些黏蛋白和對二甲氨基苯甲醛（p-dimethylaminobenzaldehyde）在酸性溶液中共同加熱可形成紫色物質(zhì),。同年，德國的穆勒（F.Muller）描述將這些粘液物質(zhì)在堿性條件下稍微加熱后,，隨后在較高溫度下與酸性的對二甲氨基苯甲醛一起孵育,，會形成鮮艷的紅色。現(xiàn)在對二甲氨基苯甲醛和50%的鹽酸混合物被稱為埃利希試劑（Ehrlich’s reagent）,， 經(jīng)常用于檢測吲哚,、吡咯和致幻劑LSD，但該反應在揭示唾液酸結構方面發(fā)揮了重要作用,。1927年,，德國的沃爾茲（E. Walz）和美國的萊文（P. Levene）與蘭德施泰納 (K. Landsteiner)報道，將源自牛脾/馬腎/牛腎/牛腦中的脂類物質(zhì)與苔黑素（orcinol）在含有氯化鐵或醋酸銅的鹽酸溶液中加色后會形成紅紫色,，該試劑后來被稱為比亞爾試劑（Bial’s reagent）,已經(jīng)成為了碳水化合物存在的通用測試方法,。戊糖會呈現(xiàn)出藍綠色，而己糖則呈現(xiàn)黃褐色,。因此,，實驗中所觀察到的紅紫色其實非常耐人尋味。

圖3 菲利克斯·霍普-塞勒，爪哇金絲燕以及西方關于燕窩的第一例系統(tǒng)性研究,。保羅·埃利希因對免疫學的貢獻獲得了1908年諾貝爾生理學與醫(yī)學獎,，殊不知他還是一個功夫了得的化學家，埃利希試劑至今仍被用于致幻劑麥角酸二乙基酰胺（LSD）的快速化學檢測,。比亞爾試劑的檢測效果因碳水化合物的類型不同而各異,。

千人千面，同歸殊途

究竟是哪個研究小組率先發(fā)現(xiàn)和分離了唾液酸,？這個問題的答案眾說紛紜且分布在世界各地：瑞典烏普薩拉大學的貢納·布利克斯（Gunnar Blix）,？德國圖賓根大學和科隆大學的厄內(nèi)斯特·克倫克（Ernst Klenk）？還是澳大利亞墨爾本沃爾特和伊麗莎霍爾研究所和德國圖賓根馬克斯普朗克病毒研究所的阿爾弗雷德·戈特沙爾克,？有趣的是,，以完全不同生物來源的材料作為檢測源，在他們的探索之旅中發(fā)揮了重要的作用,。

1936年,，布利克斯及同事以沸水作為溶液，從牛頜下腺黏蛋白中抽提分離出了一種強酸性化合物,，他稱之為“1號碳水化合物”（Kohlenhydrat I）,。該化合物通過自發(fā)的水解過程得以生成，并且能夠以晶體形式獲得,，具有還原性,。元素分析得出的化學式為C14H24NO11。微量化的乙酰測定表明,，該化合物的單個分子中存在著兩個乙?；鳛殛幮詼y試的茚三酮反應則推測出存在一個N-乙?；Y構,。產(chǎn)物的熔點為140-150°C (分解溫度)。紫外光譜檢測表明化合物不存在不飽和的乙烯鍵,。該化合物對稀無機酸加熱非常敏感,，導致形成深色的腐殖質(zhì)（humin）。與埃利希試劑一起加熱時,，無論是否經(jīng)過堿的預處理,，都會形成深紅紫色的焰色反應。綜合考慮以上觀察結果,，布利克斯認為：該化合物應該具有軟骨胺（chondrosamine）部分和具有六個碳原子的多羥基酸部分共同組成的二糖結構，而不是以己糖醛酸的形式存在（需要注意的是,，布來克斯并未從該物質(zhì)中成功分離出己糖胺結構）,。最初有人提出。己糖胺部分應該是半乳糖胺結構，但隨后因為軟骨胺的成功分離而被證偽,。有人指出,，這兩種化合物“可能以極其易斷裂的化學鍵兩相結合”。另一個早期觀點是期中的多羥基酸可能是脫氧己糖醛酸,。由于“1號碳水化合物”來源于唾液（希臘語σíαλoν）,，布利克斯將該化合物稱為“唾液酸”。

在后續(xù)的工作中,，布利克斯發(fā)現(xiàn)牛腦組織中所謂的“初磷脂“（protagon）組分也能產(chǎn)生埃利希試劑和比亞爾顏色反應,。而幾年前，厄內(nèi)斯特·克倫克已經(jīng)提出了用比亞爾試劑將人腦的脂質(zhì)”變成”紅色物質(zhì),。該團隊在1941年成功分離出一種結晶形式的含氮有機酸,，并因來源于神經(jīng)元相關，將其稱為“神經(jīng)氨酸”（neuraminic acid）,。由于在酸性介質(zhì)中進行實驗,，通常會因化合物的不穩(wěn)定性導致形成黑色的腐殖質(zhì)，他們選擇了甲醇-鹽酸處理脂質(zhì)材料,，隨后通過其鋇鹽將釋放的物質(zhì)轉化為游離酸,。元素分析獲得的化學式為：首選化學式為C11H21NO9。茚三酮反應呈陽性,，表明化合物中存在著游離氨基,，但并未表現(xiàn)出還原性。比亞爾和埃利希反應則均呈現(xiàn)強陽性,。檢測“神經(jīng)氨酰酸”中己糖胺部分的方案最終未能成功,，因此他們認為該化合物具有脂肪族聚氧氨基二羧酸結構。當克倫克意識到分離獲得的物質(zhì)經(jīng)過甲醇-鹽酸處理過程時會引入甲氧基時（后于20世紀50年代使用14C標記的甲醇予以證明）,，他將“神經(jīng)氨酰酸”重新命名為“甲氧基神經(jīng)氨酸”,，并保留了化學式為 C10H19NO9（即C11H21NO9 去掉亞甲基）作為代表“神經(jīng)氨酸”的名稱。據(jù)此,，“神經(jīng)氨酸”可能含有活性羰基,，從而能夠與其他單糖形成糖苷鍵。在隨后的一項研究中,，他們將含有“神經(jīng)氨酸”的腦糖脂稱之為“神經(jīng)節(jié)苷脂”（ganglioside）,，該名稱也延續(xù)至今。

除了黏蛋白和腦糖脂研究領域對這些全新但未知的化合物展現(xiàn)出科學興趣外,，一個有趣的新角度來自于病毒學領域,。20世紀40年代末，博耐特（F.M. Burnet）團隊報道,，各種黏蛋白（即血清黏蛋白,、卵巢囊腫黏塊、絨毛膜促性腺激素）在用活性病毒預處理后，失去了作為加熱失活的流感病毒B血液凝集的競爭性抑制劑的能力,。隨后阿爾弗雷德·戈特沙爾克發(fā)現(xiàn),，將甲型流感病毒的墨爾本株與卵黏蛋白（ovomucin）（一種含有強效病毒血凝素抑制劑的蛋白質(zhì)組分）一起孵育，產(chǎn)生了一種具有還原形的,、水溶性的含氮化合物,，經(jīng)過埃利希試劑堿處理后呈現(xiàn)紫色；此外,，采用莫利希碳水化合物試驗（Molisch carbohydrate test）,，即濃硫酸和α-萘酚的混合試劑檢測，可呈現(xiàn)強陽性,。酸處理最終導致黑色的不溶性腐殖質(zhì)形成,。將卵黏蛋白與霍亂弧菌的濾液一起孵育，可產(chǎn)生具有類似性質(zhì)的物質(zhì),。長久以來,，致病菌濾液中的酶樣組分，被稱為“受體破壞酶”（receptor-destroying enzyme,，RDE）,。根據(jù)迄今為止的結果，有研究者提出酶促過程釋放了一種“碳水化合物-肽復合物”,，并指出碳水化合物的部分應該是“一種寡糖,，含有一個或多個 N-乙酰基（乙?；┘禾前窔埢?，并且通過堿不穩(wěn)定的糖苷鍵與非氨基糖相連”。兩年后,，戈特沙爾克重復了人類尿液黏蛋白與乙型流感病毒的孵育實驗,，提出釋放出的化合物應為“N-取代的異葡萄糖胺”，即果糖胺,；N-1-脫氧-1-酮糖氨基酸或肽,。有趣的是，通過謝里瓦諾夫試驗（Seliwanoff reagent）,，即間苯二酚/濃鹽酸試驗表明,，該物質(zhì)中確實存在酮。

1975年,，布利克斯在寫給克勞斯·斯托里克（Klaus Storiko）的一封信中,，描述了他與戈特沙爾克的第一次接觸：

“...我記得1949年在劍橋舉行的第一屆國際生物化學家大會上，我與斯泰西和戈特沙爾克交談,，當時后者描述了抑制病毒血凝的黏蛋白中碳水化合物成分的一般特性,，并向斯泰西征求意見,。我立刻意識到，戈特沙爾克提到的一些特性,，使我強烈地回憶起了唾液酸?；氐郊液?，我把我們寫的關于唾液酸的文章寄給了戈特沙爾克，并告訴他我們打算對這個問題進行更為深入的驗證,。戈特沙爾克當時顯然還不了解唾液酸,，除了科隆和烏普薩拉之外，人們對這東西的興趣仍然不大,。而我對博耐特的研究也是知之甚少,。我們后來同意在各自的實驗室中明確地研究的塔姆-霍斯福爾糖蛋白（Tamm-Horsfall glycoprotein）中的碳水化合物成分，并于1952年同時在《自然》雜志上發(fā)表了我們的研究結果...”

圖4 三個和尚有口水吃…貢納·布利克斯,，厄內(nèi)斯特·克倫克和阿爾弗雷德·戈特沙爾克

未完待續(xù)

本文轉載自公眾號：“謝然課題組”

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