——背景——

心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成死亡的主要疾病之一,。低密度脂蛋白（LDL）含量的升高是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病最重要的因素,。正常情況下，飲食攝入和肝臟合成的脂質(zhì)會在肝臟中被載脂蛋白apoB100打包,，形成分泌性的極低密度脂蛋白（VLDL）,。富含甘油三酯的VLDL在外周組織中的脂解作用下，轉(zhuǎn)換為富含膽固醇的LDL并保留一份apoB100,。血液循環(huán)中的絕大多數(shù)LDL會與細(xì)胞表面的LDL受體（LDLR）結(jié)合然后被內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞,。如果這一過程受到干擾，低密度脂蛋白中攜帶的膽固醇（LDL-C）就會在血漿中積累并沉積在血管壁上,，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生,。

由于LDL結(jié)構(gòu)和組成成分的異質(zhì)性，之前尚未有高分辨的結(jié)構(gòu)被解析,。近日,，來自NIH的Joseph Marcotrigian和Alan T. Remaley課題組在nature發(fā)表了他們合作解析的結(jié)合低密度脂蛋白受體的載脂蛋白B100的結(jié)構(gòu)[1]。他們發(fā)現(xiàn)：LDLR與apoB100的兩個不同表面結(jié)合,，從而導(dǎo)致LDL的二聚化,；許多與家族性高膽固醇血癥（Familial Hypercholesterolaemia, FH）相關(guān)的變異定位于apoB100-LDLR結(jié)合界面。這些結(jié)構(gòu)研究不僅加深了對LDL細(xì)胞攝取機(jī)制的理解,，還對心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及其治療具有重要意義,。

——主要結(jié)果——

LDLR介導(dǎo)了LDL的二聚化

如LDLR超家族中的其他成員，低密度脂蛋白受體是一種模塊化的I型跨膜蛋白,。其胞外區(qū)包含7個LDLR A型模塊（LA1-LA7）,，3個表皮生長因子樣模塊（EGF-A/B/C），1個一個 β-螺旋槳域,，1個O-糖基化區(qū)域和一段C 端跨膜螺旋,。作者實(shí)驗(yàn)所用的LDLR胞外區(qū)通過重組表達(dá)及純化獲得，低密度脂蛋白通過密度梯度離心從新鮮人血漿中分離獲得,。作者通過BLI測定發(fā)現(xiàn)純化的LDLR能夠以高親和力結(jié)合與LDL,，其解離常數(shù)（Kd）為1.2~2.2 nM，并呈現(xiàn)快結(jié)合慢解離的模式（kon: 0.9~1.1 × 10? M?1 s?1,，koff: 1.3~2.1× 10?3 s?1）,。作者用質(zhì)量光度法測定發(fā)現(xiàn),，LDLR在溶液中以單體形式存在。當(dāng)LDLR加入LDL后,，通過尺寸排阻色譜（SEC）能夠觀察到高階復(fù)合物的出現(xiàn),。

ApoB100的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性

由于LDL結(jié)構(gòu)和組分的異質(zhì)性，以及缺乏明顯的表面特征,，之前的研究者通過cryoEM僅獲得了較低分辨率的結(jié)構(gòu)（9埃左右）,。在本研究中，為了對LDL顆粒進(jìn)行對齊和分類,，作者設(shè)計(jì)了一種約為120 kD的剛性且不對稱的“樂高抗體（legobody）”,。通過篩選已發(fā)表的結(jié)合LDL的納米抗體（nanobody），作者篩到了能以高親和力與LDL形成穩(wěn)定復(fù)合物的納米抗體Nb4,，并通過結(jié)合實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了含有Nb4的樂高抗體對LDL的結(jié)合不會影響LDLR和LDL的結(jié)合,。

通過尺寸排阻色譜獲得LDL-LDLR-legobody復(fù)合物的峰尖樣品后，作者進(jìn)行了單顆粒冷凍電鏡的數(shù)據(jù)收集,。盡管micrograph中能夠看到LDL二聚體，但最初仍將其作為單體進(jìn)行顆粒挑選,。通過迭代挑選和重建,，作者得到了分別為單體和二聚體的兩類LDL顆粒（圖1a, b）。在二聚體顆粒的密度中,，可以看到兩顆LDL被兩條密度橋（LDLR）連接,，形成LDL-LDLR-legobody的2:2:2的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。每條橋的一端連接在 LDL 表面的一系列小密度,，形成一個沿 LDL 表面的脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（圖 1a’ “ridge”）,。橋的另一端為一個大球狀結(jié)構(gòu)，連接到 LDL 的一個突起特征上（圖 1c,e）

圖1. LDL-LDLR-legobody 復(fù)合物的冷凍電鏡密度重建

ApoB100-LDLR-legobody的復(fù)合物結(jié)構(gòu)

作者對1:2:1的顆粒進(jìn)行進(jìn)一步分類挑選,，然后得到了分辨率為 5.41 ? 的 1:2:1 復(fù)合物密度圖（圖2b）,。作者對legobody及其鄰近的apoB100和LDLR部分進(jìn)行局部精修，以及單獨(dú)對nanobody周圍區(qū)域進(jìn)行精修,，分別達(dá)到了4.18 ?和3.73 ?的分辨率（圖2c, e）,。在這樣的分辨率下，可以清晰解析β折疊和有序的側(cè)鏈密度,，并進(jìn)行模型構(gòu)建,。

圖2. 結(jié)合LDLR和legobody的apoB100的密度重建與結(jié)構(gòu)

與其他載脂蛋白類似，apoB100被預(yù)測包含大量兩親性α螺旋,。然與它們不同的是,，apoB100還包含兩親性β片層，這種β片層與表面脂質(zhì)的結(jié)合比兩親性α螺旋更緊密,，這可能解釋了為什么apoB100無法像其他載脂蛋白一樣被交換,。作者將AlphaFold2預(yù)測的apoB100的二級結(jié)構(gòu)和冷凍電鏡數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致；但預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在顯著的差異,。作者認(rèn)為這可能是脂質(zhì)的存在對apoB100結(jié)構(gòu)的影響,。通過將解析的apoB100的模型片段和之前報道的legobody和LDLR的結(jié)構(gòu)擬合到冷凍電鏡密度圖中，作者得到了分辨率優(yōu)于 6 ? 的密度圖,。對于apoB100中過于異質(zhì)以至于無法解析的區(qū)域,，其殘基范圍在示意圖中以棕色和灰色數(shù)字標(biāo)注（圖3a）。

圖3. apoB100, LDLR和legobody的示意圖和共識模型

從解析的結(jié)構(gòu)可以看出,，apoB100 形成一個大型的兩親性筏狀結(jié)構(gòu),，包裹在 LDL 疏水核心脂質(zhì)（膽固醇酯和甘油三酯）的表面。ApoB100 的 NTD在結(jié)構(gòu)上與脂蛋白卵黃素和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似,，由半β桶,、α螺旋體、βA片層和βB片層亞結(jié)構(gòu)域組成,，是apoB100唯一具有顯著三級結(jié)構(gòu)的部分（圖2a和圖3）,。在NTD之后，一個五段 （panel）β帶形成包繞LDL直徑的環(huán),。C端β折疊嵌入NTD的β 桶下方,，將LDL表面劃分為靠近二聚軸和遠(yuǎn)離二聚軸的兩個半球（圖3b）。每一段β帶包含一個兩親性β片層,，通過四個連接點(diǎn)和連在β片層兩側(cè)的兩親性α螺旋環(huán)共同組成完整的β帶,。兩親性α螺旋環(huán)分布在靠近或遠(yuǎn)離二聚軸的半球（圖3），如α2和α3是這些環(huán)中最大的部分,。作者還通過紫外交聯(lián)和質(zhì)譜分析驗(yàn)證了模型的正確性,。

ApoB100 具有其他大型可溶性球狀蛋白或膜型蛋白中未觀察到的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。得益于 βA 片層和 βB 片層的兩親性特性,，apoB100的NTD 位于脂質(zhì)核心的頂部,，并通過七個二硫鍵維持其自身的疏水核心。蛋白C端的四分之三則形成了一個大型的不包含疏水核心的兩親性結(jié)構(gòu),。

ApoB100與LDLR的結(jié)合位點(diǎn)

通過結(jié)構(gòu)分析,，LDLR與apoB100的兩個結(jié)合位點(diǎn)（BS1和BS2）之間相距8納米。BS1位點(diǎn)位于apoB100 的3050-3600位殘基,，由一系列序列上不連續(xù)的殘基組成（圖4a）,。BS2位于apoB100的NTD的β桶上，被LDLR的β-螺旋槳結(jié)構(gòu)占據(jù)（圖4b）,。作者通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了從模型中得到的結(jié)合位點(diǎn)的準(zhǔn)確性,，并且確定了兩個位點(diǎn)分別由兩個LDLR分子分別結(jié)合，不存在單個LDLR分子能夠同時結(jié)合兩個位點(diǎn)。

圖4. apoB100和LDLR之間的相互作用

作者鑒定出LDLR的LA3–LA7 和 EGF-A結(jié)合在 apoB100 的 β 帶上的一個廣泛區(qū)域（BS1：殘基 3050–3600）,。這遠(yuǎn)超出了此前已知的兩者的結(jié)合位點(diǎn)（位點(diǎn)B：殘基3386-3396）,。許多此前報道的與LDL-C水平升高相關(guān)的apoB100和LDLR的FH突變位于作者確定的結(jié)合界面。此前,，人們對于位于 β 帶中殘基 3050到3600之間且位于位點(diǎn)B之外的FH突變（如殘基 3059,、3344、3394,、3396,、3527、3558 和 3590）的機(jī)制無法理解,，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這些突變殘基正好位于作者確定的LDL-LDLR結(jié)合界面上（圖4a,，b）。作者還用從攜帶apoB100突變R3059C的FH患者中分離得到LDL進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),，發(fā)現(xiàn)與未攜帶該突變的個體相比,，患者來源的LDL在培養(yǎng)細(xì)胞中的攝取率降低了28%。而攜帶apoB100 突變K3394N和R3527Q的個體來源的LDL,，其在細(xì)胞中的攝取率下降約50%,。

LDLR介導(dǎo)的LDL的攝取

由于LDLR在LDL上的兩個結(jié)合位點(diǎn)之間相距8納米，根據(jù)空間位置約束,，BS1和BS2必須由不同的LDLR分子占據(jù),。通過結(jié)構(gòu)比對，作者認(rèn)為,，盡管VLDL中也含有apoB100，但其可能沒有合適的構(gòu)象與LDLR結(jié)合,。與19-21納米的LDL相比,，單個直徑達(dá)30-60納米的VLDL（藍(lán)色圓圈）的體積要大得多，這可能也會阻止兩個脂蛋白被招募到一個二聚受體復(fù)合物中（圖5a）,。

之前有研究人員推測,，在內(nèi)吞和內(nèi)體酸化之后，LDLR的質(zhì)子化會引發(fā)電荷排斥并釋放LDL,，從而使LDLR能夠循環(huán)回到細(xì)胞表面,。將LDL結(jié)合狀態(tài)下的LDLR中的LA7和EGF-A（紫色絲帶）和低pH下的自我結(jié)合形式的晶體結(jié)構(gòu)（灰色）進(jìn)行疊加表明，LDLR在這一過程中可能經(jīng)歷兩次旋轉(zhuǎn),，將β螺旋槳和LA4–LA5上的兩個apoB100結(jié)合表面（粉色）拉到一起（圖5b）,。一個潛在的旋轉(zhuǎn)點(diǎn)（橙色圓圈）位于由EGF-B占據(jù)的密度橋處，旋轉(zhuǎn)后,，β螺旋槳上的LDL結(jié)合殘基朝向相反方向移動,。另一個潛在的旋轉(zhuǎn)點(diǎn)（藍(lán)色圓圈）位于LA6和LA7之間，圍繞這一點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)使LA5移動9 nm進(jìn)入自我結(jié)合構(gòu)型,。因此,，兩個結(jié)合表面均被遮擋,，LDLR可以循環(huán)回到細(xì)胞表面。

圖5.低pH下LDLR與LDL的解離模型

——總結(jié)——

在本研究中,，作者通過單顆粒冷凍電鏡和交聯(lián)分析相結(jié)合,，構(gòu)建了apoB100與LDLR結(jié)合的高分辨率結(jié)構(gòu)。研究得到的模型展示了apoB100上多個結(jié)合位點(diǎn)如何增強(qiáng)結(jié)合的親和性,；LDLR如何以二聚體形式結(jié)合LDL,；以及LDLR如何在LDL結(jié)合構(gòu)型與自結(jié)合構(gòu)型之間循環(huán)。這些發(fā)現(xiàn)為解釋apoB100或LDLR中已知的突變?nèi)绾谓档蚅DL與LDLR的結(jié)合并導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥（FH）表型提供了結(jié)構(gòu)背景,。這些機(jī)制性見解可能為未來開發(fā)基于結(jié)構(gòu)的降低LDL-C水平的療法提供可能,，并為進(jìn)一步研究開啟了新的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Reimund, M., Dearborn, A.D., Graziano, G. et al. Structure of apolipoprotein B100 bound to the low-density lipoprotein receptor. Nature (2024). https:///10.1038/s41586-024-08223-0