基于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)(TALE)的工具用于細胞核和細胞器DNA的堿基編輯,，依賴于雙鏈DNA脫氨酶，它編輯兩條DNA鏈上的底物堿基,，降低了編輯精度,。
2023年8月28日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞團隊聯(lián)合北京齊禾生科生物科技有限公司在Nature Biotechnology 在線發(fā)表題為“Strand-preferred base editing of organellar and nuclear genomes using CyDENT”的研究論文,，該研究提出了CyDENT堿基編輯,，一個無 CRISPR、鏈選擇性,、模塊化堿基編輯器,。CyDENT包括一對與FokI酶，單鏈特異性胞苷脫氨酶和外切酶融合的TALEs,，以產(chǎn)生用于脫氨的單鏈DNA底物,。該研究在細胞核、線粒體和葉綠體基因組中展示了有效的堿基編輯,。在某些線粒體位點,，顯示編輯效率為14%，鏈特異性為95%,。此外,，通過將CyDENT脫氨酶與更傾向于編輯GC基序的酶交換，作者在其他方法無法編輯的位點上展示了高達20%的線粒體堿基編輯。CyDENT的模塊化特性為各種應(yīng)用程序提供了一套定制的基礎(chǔ)編輯器,。線粒體是基本的半自主細胞器,，擁有自己的基因組。人類線粒體基因組是一個16.6 kb的雙鏈環(huán)狀DNA(線粒體DNA (mtDNA)),，包含37個基因,，編碼13個呼吸鏈復(fù)合物亞基、2個RNAs和22個轉(zhuǎn)移RNAs (tRNAs),。根據(jù)mitomap數(shù)據(jù),，在mtDNA中發(fā)現(xiàn)了超過19,500個單核苷酸變異(SNVs)，其中超過250個被認為與疾病相關(guān),，包括Leber 's遺傳性視神經(jīng)病變,，Leigh 's綜合征，進行性腦肌病,，MELAS等,。基于CRISPR的基因組編輯技術(shù),，包括CRISPR-Cas核酸酶,、堿基編輯器和初始編輯器，是能夠固定不同核基因組變異的強大工具,；然而,，這些工具不能有效地編輯mtDNA，因為單導(dǎo)RNA無法傳遞到線粒體,。CyDENT堿基編輯的示意圖概述（圖源自Nature Biotechnology）最近,，兩種基于蛋白質(zhì)的工具，雙鏈DNA脫氨酶(DddA)衍生的胞嘧啶堿基編輯器(DdCBE) 和TALE-linked脫氨酶(TALED)被開發(fā)出來,，可以在mtDNA中進行精確的堿基編輯,。DdCBE和TALED都依賴于DddA，一種雙鏈DNA (dsDNA)脫氨酶,，以分裂形式融合到一對TALE蛋白上,，以指導(dǎo)可編程的堿基編輯。雖然DdCBE和TALED都可以分別在mtDNA中進行高效的C·G到T·A和A·T到G·C堿基轉(zhuǎn)換,，但這些編輯器對DNA靶鏈特異性缺乏任何精度,。由于DddA蛋白在指導(dǎo)任何堿基轉(zhuǎn)換中都是必不可少的，它靶向DNA兩條鏈上的底物堿基,，從而使目標DNA兩條鏈上的胞嘧啶和腺嘌呤堿基被編輯，從而導(dǎo)致額外的不希望的突變,。因此,，有必要開發(fā)鏈特異性的無CRISPR堿基編輯器，以便基于蛋白質(zhì)系統(tǒng)在細胞器和核DNA中進行精確的堿基轉(zhuǎn)換。該研究提出了一個模塊化的堿基編輯系統(tǒng),，胞苷脫氨酶-核酸外切酶-鎳酶-TALE (CyDENT),，它執(zhí)行無CRISPR、鏈選擇性DNA編輯,。CyDENT是由一對可編程的TALE蛋白,、單鏈DNA (ssDNA)脫氨酶、缺口酶和核酸外切酶組成的模塊化組裝體,。重要的是,，CyDENT在人類細胞中實現(xiàn)了高效和鏈選擇性的線粒體堿基編輯。中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組博士后胡佳成,，碩士生孫瑜,，博士生李帛樹為該論文的并列第一作者；高彩霞研究員與齊禾生科生物科技有限公司的Kevin Tianmeng Zhao博士為本文共同通訊作者,。該研究得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部,、中國科學院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項、國家重點研發(fā)計劃項目,、國家自然科學基金等項目的資助,。
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