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DddA 衍生的胞嘧啶堿基編輯器 (DdCBE) 是分裂 DddA 半部分和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應器 (TALE) 陣列蛋白的融合體,，可實現(xiàn)線粒體 DNA 中的靶向 C·G 到 T·A 轉(zhuǎn)換,。然而，人們對其全基因組特異性知之甚少,。 2022年5月12日,，北京大學伊成器團隊在Nature發(fā)表題為「Mitochondrial base editor induces substantial nuclear off-target mutations」的研究論文，該研究顯示線粒體堿基編輯器在核基因組中誘導廣泛的脫靶編輯,。對其編輯組的全基因組,、無偏分析揭示了數(shù)百個與 TALE 陣列序列 (TAS) 相關或獨立的脫靶位點。
核 DNA (nDNA) 中依賴于 TAS 的脫靶位點通常僅由兩個 TALE 重復序列中的一個指定,，這挑戰(zhàn)了 DdCBE 由靠近定位的配對 TALE 蛋白引導的原則,。與 TAS 無關的 nDNA 脫靶位點經(jīng)常在具有不同 TALE 陣列的 DdCBE 之間共享。值得注意的是,，它們與 CTCF 結(jié)合位點強烈共定位,，并且富含 TAD 邊界。該研究還設計了 DdCBE 來減輕這種脫靶效應,?？偟膩碚f，該研究結(jié)果對在基礎研究和治療應用中使用 DdCBE 有影響,，并表明需要徹底定義和評估堿基編輯工具的脫靶效應,。
2022年4月25日，韓國基礎科學研究所Jin-Soo Kim（音譯,，金鎮(zhèn)洙）團隊在Cell在線發(fā)表題為「Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases」的研究論文,，該研究該提出了可編程的 TALE 連接脫氨酶，由定制設計的 TALE 蛋白,、分裂或催化缺陷的 DddA 變體和工程化的腺嘌呤脫氨酶組成,，可誘導人線粒體中的靶向 A-to-G 編輯。定制設計的 TALED 在人體細胞中非常有效,，可在各種線粒體基因的 17 個靶位點催化 A 到 G 的轉(zhuǎn)換,，編輯頻率高達 49%?？偟膩碚f,，在短期內(nèi)，TALED 將有助于在細胞系和動物中產(chǎn)生 mtDNA 突變以創(chuàng)建疾病模型,，這是藥物開發(fā)的重要步驟,。在 mitomap 中列出的 90 個已確認的致病性 mtDNA 點突變中,，其中 42 個（=47%）可以使用 TALED 在人類細胞系或模型生物中產(chǎn)生，從而實現(xiàn) A-to-G 轉(zhuǎn)換,，而只有 9 個（=10%）的 可以使用催化 TC 到 TT 轉(zhuǎn)換的 DdCBE 來誘導突變,。從長遠來看，具有更高效率和特異性的 TALED 可以為糾正胚胎,、胎兒,、新生兒或成年患者中引起疾病的 mtDNA 突變鋪平道路，預示著線粒體基因治療的新時代,。此外,，正如最近 DdCBEs 所示，編碼植物中數(shù)百個基因的葉綠體 DNA（其中許多基因?qū)夂献饔弥陵P重要）可以用植物兼容的 TALED 進行編輯,，從而開啟植物遺傳學和生物技術(shù)的新篇章,。
2022年4月4日，博德研究所劉如謙團隊在Nature Biotechnology發(fā)表題為「CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA」的研究論文,，該研究為了提高編輯效率并克服 DddA 嚴格的 TC 序列約束,，使用噬菌體輔助的非連續(xù)和持續(xù)進化來進化具有改進活性和擴大靶向范圍的 DddA 變體。DddA6 和 DddA11 大大提高了全蛋白堿基編輯的有效性和適用性,。
2022年3月18日,，中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉、中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝,、上海腦科學與類腦研究中心/臨港國家實驗室胥春龍,、上海交通大學章美玲共同通訊在 Cell Discovery （IF=11）發(fā)表題為「Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos」的研究論文，該研究使用 GOTI方法（點擊閱讀）,，以評估 DdCBE 對 mtDNA 和核 DNA 修飾的脫靶效應,。該研究首次展示了 DdCBE 在整個核基因組中導致數(shù)千個脫靶 SNV，這些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 轉(zhuǎn)換,，這是低保真堿基編輯器 BE3 產(chǎn)生的 SNV 數(shù)的兩倍,。總之，該研究發(fā)現(xiàn)DdCBE 對核基因組具有廣泛的脫靶效應,，強烈需要優(yōu)化 DdCBE 以在 mtDNA 上進行特定的堿基編輯,，特別是在用于治療線粒體疾病之前。
2022年2月1日,，上海交通大學章美玲,，李文及中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝共同通訊在 Cell Discovery發(fā)表題為「Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE」的研究論文，該研究表明,，DdCBE 是一種有效的堿基編輯器,，可在人類胚胎 mtDNA 中誘導點突變，并且在 8 細胞胚胎中的效率要高得多,。 鑒于旁觀者和脫靶編輯特征,，DdCBE 仍有待進一步優(yōu)化用于未來的基礎和治療研究。
2022年2月1日,，南京醫(yī)科大學許爭鋒,、沈斌及凌秀鳳共同通訊在 Cell Discovery發(fā)表題為「DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos」的研究論文，該研究首次證明了在人類 3PN 胚胎中進行 DdCBE 介導的線粒體堿基編輯的可行性,，表明在人類早期胚胎階段進行致病性 mtDNA 突變校正的可能性,。 理論上，DdCBE可以糾正mtDNA中的一系列致病性A???T-to-G???C突變,，從而達到治療效果,。盡管在 3PN mtDNA 中檢測到的脫靶編輯可能不足以產(chǎn)生表型，但當前的線粒體堿基編輯策略需要進一步優(yōu)化以滿足任何臨床應用的需求,。
2020年7月8日,，博德研究所David R. Liu及華盛頓大學醫(yī)學院Joseph D. Mougous共同通訊在Nature發(fā)表題為「A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing」的研究論文，該研究描述了一種細菌間毒素,，將其命名為DddA,，它可以催化dsDNA中胞苷的脫氨。該研究設計了無毒且無活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分結(jié)構(gòu)域（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應子陣列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑的融合,，產(chǎn)生了無RNA的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器（DdCBE）,，可催化人mtDNA中的C·G到T·A轉(zhuǎn)化，具有高靶標特異性和產(chǎn)品純度,。該研究使用DdCBEs建模人類細胞中與疾病相關的mtDNA突變,，從而導致呼吸速率和氧化磷酸化的改變。不含CRISPR的DdCBE可以精確操縱mtDNA,，而不是消除因被靶向核酸酶切割而產(chǎn)生的mtDNA拷貝,，這對線粒體疾病的研究和潛在治療具有廣泛的意義。已知線粒體 DNA (mtDNA) 的突變與大多數(shù)成人發(fā)病的線粒體疾病有關,，每 5000 名成人中約有 1 人受到影響,。雖然已經(jīng)報道了很多與 mtDNA 突變相關的嚴重綜合征，但有效的治療方法很少,，也沒有已知的治愈方法,。 為了應對這樣的挑戰(zhàn)，已經(jīng)開發(fā)了各種基因治療策略,。例如,，線粒體靶向核酸酶，如鋅指核酸酶 (ZFN) 和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN),，已被用于通過直接降解突變的 mtDNA 分子來降低細胞中的異質(zhì)性水平,。最近，據(jù)報道,，無 RNA 的 DddA 衍生的胞嘧啶堿基編輯器 (DdCBE) 可以精確編輯 mtDNA 而不會導致雙鏈斷裂,。因此,，與以前基于破壞的策略不同，新方法不會將 mtDNA 的拷貝數(shù)降低到有害的低水平,，特別是對于高突變負荷的情況,。線粒體堿基編輯器基于 DddAtox，這是一種細菌毒素,，可催化雙鏈 DNA (dsDNA) 上的脫氧胞嘧啶 (dC) 轉(zhuǎn)化為脫氧尿嘧啶 (dU),。為了避免潛在的毒性，脫氨酶被分成兩半,，一個包含 DddAtox 的 N 末端 (DddAtox-N),，另一個包含 C 末端 (DddAtox-C)。當由一對線粒體靶向信號 (MTS) 連接的 TALE 蛋白組裝時,，這些半部分將重建脫氨活性,，其方式類似于 ZFN 和 TALEN 中 FokI 單體的組裝。因此,，只有當兩個 TALE 重復同時與目標基因組位點結(jié)合時,，DdCBE 才誘導預期的 dC 到 dU 編輯。
提高 DdCBE 特異性的策略 ｜ 圖源：Nature雖然 DdCBE 是一種很有前途的線粒體疾病方法,，但仍缺乏對其脫靶效應的公正和全面的分析,。Mok 及其同事根據(jù)對核假基因的分析，報告了 mtDNA 中不同程度的脫靶編輯,，并且在核 DNA (nDNA) 中沒有脫靶效應,；然而，DdCBE 的全基因組特異性仍未得到解決,。該研究顯示線粒體堿基編輯器在核基因組中誘導廣泛的脫靶編輯,。對其編輯組的全基因組、無偏分析揭示了數(shù)百個與 TALE 陣列序列 (TAS) 相關或獨立的脫靶位點,。核 DNA (nDNA) 中依賴于 TAS 的脫靶位點通常僅由兩個 TALE 重復序列中的一個指定,，這挑戰(zhàn)了 DdCBE 由靠近定位的配對 TALE 蛋白引導的原則。與 TAS 無關的 nDNA 脫靶位點經(jīng)常在具有不同 TALE 陣列的 DdCBE 之間共享,。值得注意的是,，它們與 CTCF 結(jié)合位點強烈共定位，并且富含 TAD 邊界,。該研究還設計了 DdCBE 來減輕這種脫靶效應,。總的來說,，該研究結(jié)果對在基礎研究和治療應用中使用 DdCBE 有影響,，并表明需要徹底定義和評估堿基編輯工具的脫靶效應。[1]https://www./articles/s41586-022-04836-5[2]https://www./cell/pdf/S0092-8674(22)00389-0.pdf[3]https://www./articles/s41587-022-01256-8[4]https://www./articles/s41421-022-00391-5[5]https://www./articles/s41421-021-00372-0[6]https://www./articles/s41421-021-00358-y[7]https://www./articles/s41586-020-2477-4
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