質(zhì)粒小科普

質(zhì)粒(Plasmid)是廣泛存在于生物界中的環(huán)狀雙鏈DNA分子。目前在細(xì)菌,、放線菌,、真菌和不少動(dòng)植物細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在，其中細(xì)菌質(zhì)粒是研究最深入,、應(yīng)用最廣泛的[1],。因?yàn)橘|(zhì)粒分子本身具有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)，可攜帶一些遺傳信息，并且其自我復(fù)制能力和攜帶遺傳信息能力非常強(qiáng)大,，經(jīng)過基因表達(dá)后可使其宿主細(xì)胞表現(xiàn)相應(yīng)的性狀,，所以質(zhì)粒常被用作基因載體，在分子生物學(xué),、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[2],。

圖1 大腸桿菌質(zhì)粒分子結(jié)構(gòu)示意圖

質(zhì)粒提取方法及原理

質(zhì)粒的提取是分子克隆中常用的一種技術(shù)，即去除RNA,，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組DNA分開,，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒的過程,。質(zhì)粒的質(zhì)量直接影響到基因操作的后續(xù)步驟,，如轉(zhuǎn)化、酶切和序列分析等,，因此獲得足夠量的質(zhì)粒是質(zhì)粒應(yīng)用的重要一步,。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒的獲取方式主要是通過在大腸桿菌中擴(kuò)增，從而獲取大量的含有目的基因的載體質(zhì)粒,。其主要過程是對(duì)感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取克隆菌落,，在LB培養(yǎng)基中搖菌進(jìn)行擴(kuò)增和質(zhì)粒抽提[3],。科研工作者已經(jīng)開發(fā)出很多質(zhì)粒抽提的方法,，目前普遍采用的質(zhì)粒提取方法主要有堿裂解法,、煮沸法、SDS裂解法和有機(jī)溶劑法等,。堿裂解法提取質(zhì)粒具有得率高,，適用面廣、快速,、純度高等特點(diǎn),，因此堿裂解法目前被廣泛采用。下面著重介紹堿裂解法提取質(zhì)粒的原理,。

圖2 質(zhì)粒提取過程

堿裂解法提取質(zhì)粒主要原理是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒和線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異,。利用NaOH和SDS溶液使細(xì)胞裂解，在堿性溶液中,，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA氫鍵斷裂,，雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小,，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu),，即使在高堿性pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)充分分離。當(dāng)加入中性緩沖液調(diào)和時(shí),，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型,，而染色體DNA不能復(fù)性，它們之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，并與細(xì)胞碎片,、蛋白質(zhì)、SDS等結(jié)合沉淀下來,。通過離心沉淀,，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去,，而質(zhì)粒DNA小分子量的RNA留在上清液中,，混雜的RNA用RNaseA除去。一些可溶性蛋白,，可通過酚/氯仿抽提除去,，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。由于堿裂解法的眾多優(yōu)勢(shì),，市面上大多數(shù)的質(zhì)粒抽提試劑盒基本采用的方法是堿裂解法,。

質(zhì)粒提取分類

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)選擇基于堿裂解法的質(zhì)粒提取試劑盒來提取質(zhì)粒，根據(jù)不同的樣本量及獲取目標(biāo)質(zhì)粒的產(chǎn)量分為質(zhì)粒小提,、質(zhì)粒中提,、質(zhì)粒大提。

1,、質(zhì)粒小提

質(zhì)粒小提主要是對(duì)于1-5mL的菌液中質(zhì)粒DNA進(jìn)行小量提取,，獲得的質(zhì)粒用來進(jìn)行常規(guī)的載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

Absin金牌產(chǎn)品：無內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（abs60023）

1,、采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,，粗提物通過過濾柱除去內(nèi)毒素； 
2,、離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜,，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好,。
3,、獨(dú)有的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶,。即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列,、HB101也可以輕松去除,。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解,。
4,、獨(dú)特內(nèi)毒素清除方法,，清除內(nèi)毒素效果一般小于<0.1EU/μg。

Absin質(zhì)粒小提產(chǎn)品清單：

2,、質(zhì)粒中提

質(zhì)粒中提是在質(zhì)粒小提的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除菌液中的內(nèi)毒素，獲得的質(zhì)?？梢杂糜诩?xì)胞轉(zhuǎn)染,，常規(guī)需要菌液量為10-15mL,。

3、質(zhì)粒大提

質(zhì)粒大提與中提方法相同,，一次可對(duì)100-200mL菌液進(jìn)行抽提,，從而獲得大量質(zhì)粒。

Absin金牌產(chǎn)品：去內(nèi)毒素中大量質(zhì)粒富集提取試劑盒（abs60300）

1,、高效提取中大量菌液質(zhì)粒DNA,，提取菌液量：5mL,、10mL,、20mL、50mL、100mL或以上,；
2、提取質(zhì)粒DNA純度高,，可高效去除質(zhì)粒中污染的內(nèi)毒素,，內(nèi)毒素去除率可高達(dá)90%以上，有效提升質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的成功率,；
3,、真空濃縮，大幅提升洗脫液中質(zhì)粒DNA濃度,，DNA濃度可達(dá)2ug/uL以上,；
4,、用于培養(yǎng)菌液樣本中質(zhì)粒DNA的提取,，提取后的質(zhì)粒DNA可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染、酶切,、PCR、測(cè)序,、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯,、構(gòu)建文庫(kù)等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

Absin質(zhì)粒中提,、大提產(chǎn)品清單：

質(zhì)粒提取其實(shí)并不難,，但是選擇符合我們實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒提取方法和試劑盒非常重要,，因?yàn)橛挚煊趾玫靥崛〕龇舷掠螌?shí)驗(yàn)要求的質(zhì)粒，無疑會(huì)對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)起到錦上添花的作用,。

本期的分子小課堂就到這里啦,，祝大家實(shí)驗(yàn)順利，我們下期再見啦,！

[1] Lars M?lbak, Tett A, Ussery D W, et al. The plasmid genome database.[J]. Microbiology, 2003, 149(Pt 11):3043-5. DOI:10.1099/mic.0.C0123-0.

[2] Diaz Ricci J C ,Hernández ME. Plasmid Effects on Escherichia coli Metabolism[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2000, 20(2):79-108. DOI:10.1080/07388550008984167.

[3] Li G , Liu J , Chen N, et al. A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth[J].Bioengineered, 2020, 11(1):1080-1083.DOI:10.1080/21655979.2020.1827893.