據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球有2.96億慢性乙型肝炎(CHB)患者,，每年有150萬新發(fā)HBV感染者^[1],，我國有7 000萬HBV感染者，其中有2 000萬~3 000萬CHB患者^[2],。每年全球約有70萬人死于HBV慢性感染導(dǎo)致的肝硬化,、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等并發(fā)癥，造成了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)^[3],。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》^[4],，抗病毒治療可以有效抑制HBV的復(fù)制,，從而減少肝臟炎癥性壞死，降低肝硬化,、肝細(xì)胞癌等肝病的發(fā)病率和致死率,。目前臨床上常用的核苷酸類似物(NA)可有效降低血清病毒載量，但盡管長期治療,，仍很少實(shí)現(xiàn)功能性治愈,，宿主免疫細(xì)胞抗病毒功能并未完全恢復(fù)，且共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)在肝細(xì)胞中持續(xù)存在,，停藥后仍會發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)^[5],。HBV感染機(jī)體后，自然殺傷(NK)細(xì)胞是先天性免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,，通過細(xì)胞毒性作用或產(chǎn)生細(xì)胞因子等發(fā)揮抗病毒作用,，在慢性HBV感染期間，NK細(xì)胞功能受損,，這可能有助于病毒的持久感染^[6],。免疫檢查點(diǎn)是一類參與免疫系統(tǒng)負(fù)調(diào)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)蛋白，主要包括程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1),、淋巴細(xì)胞活化基因3(LAG-3),、T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)、T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域(TIGIT),、自然殺傷細(xì)胞2組成員A(NKG2A)等,，這些免疫檢查點(diǎn)特異性表達(dá)在T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面,。近年來大量的研究表明免疫檢查點(diǎn)參與了HBV感染的疾病發(fā)展過程,，本文將從HBV病原學(xué)、慢性HBV感染機(jī)制以及常見免疫檢查點(diǎn)在CHB中對NK細(xì)胞功能的影響等方面進(jìn)行系統(tǒng)綜述,。

1HBV

1.1   HBV病原學(xué)及生命周期

HBV由包膜和核心顆粒組成,，包膜是脂質(zhì)雙層膜，HBsAg嵌入其中,，核心顆粒包含3.2 kb的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA),、HBcAg和病毒DNA聚合酶。其基因組由四個(gè)開放閱讀框組成,，負(fù)責(zé)編碼蛋白,。在感染開始時(shí)，HBsAg識別肝細(xì)胞上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,，并以低親和力結(jié)合,，然后肝細(xì)胞表面的牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽受體介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞,，病毒包膜和肝細(xì)胞膜融合,，并將核心顆粒釋放到細(xì)胞質(zhì)中,，病毒核衣殼移除之后，病毒DNA進(jìn)入肝細(xì)胞的細(xì)胞核,，rcDNA經(jīng)DNA修復(fù)形成cccDNA,，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以在宿主細(xì)胞中持續(xù)存在,。cccDNA作為轉(zhuǎn)錄前基因組RNA以及其他信使RNA的模板，轉(zhuǎn)錄后輸出到細(xì)胞質(zhì)翻譯成病毒蛋白,，包括HBsAg,、HBcAg、HBeAg,、DNA聚合酶和乙型肝炎病毒X蛋白,，核心蛋白可以構(gòu)建成新的核衣殼，在核衣殼內(nèi),，轉(zhuǎn)錄前基因組RNA在病毒DNA聚合酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成新的rcDNA,，新的rcDNA可以進(jìn)入肝細(xì)胞核補(bǔ)充cccDNA，也可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的包膜蛋白聚集在一起進(jìn)入分泌途徑,，從肝細(xì)胞排出到血液中^[7-9](圖1),。

圖1  HBV的生命周期

1.2   慢性HBV感染機(jī)制

慢性HBV感染的機(jī)制尚未完全闡明。在HBV感染中,，先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)是控制病毒感染和清除肝內(nèi)炎癥壞死的主要原因,，但在慢性HBV感染患者中，宿主的免疫反應(yīng)就像一把雙刃劍,，一方面可以破壞被感染的肝細(xì)胞來清除HBV,，另一方面可以引起肝臟炎癥，加重肝損傷,，導(dǎo)致肝纖維化和肝細(xì)胞癌^[10-11],。Jin等^[12]分析了CHB患者外周血中各種免疫細(xì)胞亞群的百分比和功能等，發(fā)現(xiàn)CHB患者的外周血免疫細(xì)胞存在功能缺陷,，尤其是NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞,。HBV可誘發(fā)宿主免疫細(xì)胞功能障礙，引起免疫失衡和功能缺陷,，這可能是HBV感染慢性化的機(jī)制之一,。

NK細(xì)胞是維持機(jī)體先天性免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞之一，通過識別和殺死靶細(xì)胞并分泌IFN-γ,、TNF-α等細(xì)胞因子來發(fā)揮作用,，根據(jù)NK細(xì)胞膜CD56的密度，NK細(xì)胞可以被分為兩個(gè)亞群,，CD56^bright和CD56^dim,，CD56^bright NK細(xì)胞在受到刺激時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,，但細(xì)胞毒性較小，相反,，CD56^dim NK細(xì)胞則通過脫顆粒功能殺死靶細(xì)胞,，但分泌細(xì)胞因子的水平相對CD56^bright NK細(xì)胞較低^[13]。

已證實(shí)慢性HBV感染中T淋巴細(xì)胞功能衰竭是感染慢性化的重要機(jī)制,，但越來越多的研究^[12, 14-17]發(fā)現(xiàn),，在慢性HBV感染中，NK細(xì)胞的功能也是衰竭的,，主要表現(xiàn)為NK細(xì)胞的頻數(shù)及分泌的細(xì)胞因子減少,，但細(xì)胞毒性作用保持不變，這種現(xiàn)象被一些學(xué)者稱為NK細(xì)胞的“功能二分法”,，NK細(xì)胞的功能二分法有助于HBV的持續(xù)存在,。NK細(xì)胞的功能受其表面激活或抑制性受體的調(diào)控，近年來,，很多研究^[18-20]發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)分子對慢性HBV感染中NK細(xì)胞功能也有重要的影響,，在慢性HBV感染患者的NK細(xì)胞中，免疫檢查點(diǎn)分子NKG2A,、PD-1,、TIM-3、TIGIT等的表達(dá)是上調(diào)的,，致NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力降低,，并參與了肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。因此,，了解免疫檢查點(diǎn)對慢性HBV感染者NK細(xì)胞功能的影響至關(guān)重要,。

2免疫檢查點(diǎn)對慢性HBV感染者NK細(xì)胞功能的影響

2.1   NKG2A

NKG2A是C型凝集素超家族的成員，是一種單通道Ⅱ型跨膜糖蛋白,，含有細(xì)胞外凝集素樣結(jié)構(gòu)域,，跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)段，細(xì)胞內(nèi)部分有兩個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM),，參與抑制性信號傳導(dǎo),，NKG2A與CD94構(gòu)成異二聚體，NKG2A/CD94的配體有非經(jīng)典的MHC Ⅰ類分子,、人白細(xì)胞抗原E^[21],。慢性HBV感染時(shí)，NK細(xì)胞上NKG2A的表達(dá)上調(diào),，Li等^[22]分析了活動性CHB患者,、非活動性CHB患者和健康對照組的外周血NK細(xì)胞上的NKG2A水平，發(fā)現(xiàn)活動性CHB患者的NK細(xì)胞NKG2A陽性的百分比比非活動性CHB患者和健康對照組高，且NK細(xì)胞NKG2A的表達(dá)與血清病毒載量呈正相關(guān),，此外,，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠NKG2A陽性的NK細(xì)胞也比對照組小鼠更高，阻斷HBV攜帶小鼠的NKG2A信號可以降低HBV DNA,、HBsAg和HBcAg水平,。Ma等^[23]的研究同樣發(fā)現(xiàn)CHB患者中表達(dá)抑制性受體NKG2A的NK細(xì)胞百分比增加，阻斷NKG2A可以恢復(fù)NK細(xì)胞的功能,，且慢性HBV感染期間,，HBeAg可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中IL-10的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致NKK2A在NK細(xì)胞上的表達(dá)增加,，進(jìn)而導(dǎo)致NK細(xì)胞的功能障礙,。NKG2A/CD94與其配體結(jié)合后，NKK2A中的ITIM被Src家族激酶磷酸化,，磷酸化的ITIM負(fù)責(zé)招募和激活含有SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶SHIP-1、SHIP-2以及酪氨酸磷酸酶SHP-1,、SHP-2,，這些酪氨酸磷酸酶能夠通過去磷酸化作用抑制NK細(xì)胞激活受體產(chǎn)生的激活信號，最終引起NK細(xì)胞功能障礙^[21, 24],。

2.2   PD-1

PD-1于1992年被發(fā)現(xiàn),，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有單個(gè)細(xì)胞外IgV結(jié)構(gòu)域,、疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域,，其細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)含有ITIM樣基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序ITSM，PD-1的配體是PD-L1或PD-L2^[25-26],。Li等^[27]從慢性HBV感染者和健康個(gè)體的外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞,，用流式細(xì)胞術(shù)分析了PD-1在NK細(xì)胞上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)顯著高于健康對照組,。與李芬^[28]的研究結(jié)果一致,，此外，慢性HBV感染者NK細(xì)胞的頻數(shù)減少與其表面PD-1的表達(dá)上調(diào)相關(guān),。PD-1與配體結(jié)合后可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞的衰竭,，當(dāng)PD-1與其配體結(jié)合后，除了ITIM樣基序參與抑制性信號的傳導(dǎo)外,，ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸也會發(fā)生磷酸化并招募SHP-2,，阻斷磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Ras激活，分別抑制PIP3-AKT-mTOR和MEK-ERK激酶途徑傳遞的活化信號,，從而抑制免疫細(xì)胞增殖,、分化、存活和分泌細(xì)胞因子^[29]。阻斷PD-1/PD-L1通路可以直接阻斷抑制信號,，改善NK細(xì)胞的功能和活性,，也可以通過調(diào)控T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞來間接緩解NK細(xì)胞的功能抑制^[30],。慢性HBV感染者NK細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)上調(diào),，導(dǎo)致NK細(xì)胞的功能衰竭，但具體的機(jī)制需要更多的研究來進(jìn)一步說明,。

2.3   TIM-3

TIM-3于2002年首次被發(fā)現(xiàn),，由氨基末端免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾部組成,，其細(xì)胞質(zhì)尾部包含5個(gè)酪氨酸殘基,，與NKG2A和PD-1不同，TIM-3無ITIM樣基序^[31],。TIM-3有四個(gè)配體,，包括半乳糖凝集素9、癌胚抗原細(xì)胞黏附分子1,、高遷移率族蛋白B1和磷脂酰絲氨酸^[32],。在慢性HBV感染中，TIM-3在許多免疫細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等,，TIM-3的表達(dá)上調(diào)常伴有上述免疫細(xì)胞的功能受損,，而抑制TIM-3能部分恢復(fù)上述細(xì)胞的免疫功能，從而促進(jìn)病毒的清除^[33],。Ju等^[34]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CHB患者,、健康對照組和脂肪性肝病患者外周血NK細(xì)胞中的TIM-3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與健康對照組和脂肪性肝病患者相比,，CHB患者NK細(xì)胞中的TIM-3表達(dá)顯著增加,，并在被HBV載體轉(zhuǎn)染的NK92細(xì)胞和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟分離的NK細(xì)胞中也檢測到TIM-3表達(dá)增加，提示HBV感染可以上調(diào)NK細(xì)胞中的TIM-3表達(dá),；研究者還使用抗體阻斷了CHB患者外周血NK細(xì)胞上TIM-3信號的傳導(dǎo),，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性增加，分泌IFN-γ增多,，認(rèn)為TIM-3表達(dá)上調(diào)反過來可以抑制CHB患者NK細(xì)胞的功能,，阻斷TIM-3信號可以使NK細(xì)胞的功能恢復(fù)。目前,，TIM-3導(dǎo)致慢性HBV感染NK細(xì)胞功能衰竭的機(jī)制尚未完全可知,。有研究^[35-36]顯示,，TIM-3的配體磷脂酰絲氨酸與TIM-3結(jié)合可以抑制NK細(xì)胞的活化，磷脂酰絲氨酸促進(jìn)了TIM-3酪氨酸殘基的磷酸化,，然后TIM-3與PI3K p110競爭性的結(jié)合p85,，抑制下游的AKT-mTOR信號傳導(dǎo)從而導(dǎo)致NK細(xì)胞功能衰竭。此外,，HBV感染還可以增強(qiáng)肝細(xì)胞表面半乳糖凝集素9的表達(dá),，半乳糖凝集素9與NK細(xì)胞表達(dá)的TIM-3結(jié)合而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能，減少IFN-γ的產(chǎn)生,，并促使其發(fā)生凋亡,，可能為HBV感染誘導(dǎo)肝臟NK細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制之一^[37-38]。

2.4   TIGIT

TIGIT最早于2009年被確認(rèn)為一種新型免疫檢查點(diǎn),，TIGIT是CD28家族的一個(gè)新成員,，可表達(dá)于幾乎所有T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞表面，可以抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的激活^[39],。TIGIT由位于細(xì)胞外的IgV結(jié)構(gòu)域,、單通道跨膜段、胞內(nèi)段三部分組成,，其胞內(nèi)段除了ITIM樣基序,，還有免疫球蛋白酪氨酸尾樣基序^[40-41]。TIGIT的配體主要包括CD155,、CD112等，其中,，CD155與TIGIT的親和力最大^[42-43],。TIGIT與配體的相互作用可以導(dǎo)致免疫球蛋白酪氨酸尾樣基序的磷酸化，并與生長因子受體結(jié)合蛋白2結(jié)合,，招募SHIP-1抑制PI3K/MAPK信號傳導(dǎo),，阻斷核因子-κB的活化，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性^[44-45],。Yu等^[20]使用流式細(xì)胞術(shù)分析了TIGIT和TIM-3在健康供體,、CHB、HBV相關(guān)肝硬化和HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者的表達(dá),，發(fā)現(xiàn)在HBV相關(guān)疾病中,，TIGIT和TIM-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)增高，TIGIT和TIM-3具有一定比例的共表達(dá),，且參與了NK細(xì)胞的功能衰竭,。在HBV攜帶小鼠模型中，NK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)顯著上調(diào),，阻斷TIGIT后顯著降低了小鼠模型血清HBsAg水平,，且HBsAg轉(zhuǎn)陰率增高，阻斷TIGIT可以增加肝臟中NK細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的功能^[46]。

2.5   唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)-7/9

Siglec屬于Ⅰ型凝集素家族的免疫調(diào)節(jié)性唾液酸結(jié)合受體,，Siglec在多種免疫細(xì)胞上表達(dá),，大多數(shù)Siglec是抑制性受體，如Siglec-7,、Siglec-9等,。與NK細(xì)胞的抑制性受體NKG2A、PD-1等類似,，Siglecs在其細(xì)胞質(zhì)尾部也包含一個(gè)或多個(gè)ITIM樣基序,，與配體結(jié)合后，ITIM被Src家族激酶磷酸化,，招募并激活酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2進(jìn)而發(fā)揮抑制作用^[47],。在慢性HBV感染中，NK細(xì)胞Siglec-7的表達(dá)明顯下調(diào),，HBV相關(guān)肝硬化患者的疾病進(jìn)展與Siglec-7陽性NK細(xì)胞頻數(shù)降低有關(guān)^[48],。Zhao等^[49]用流式細(xì)胞術(shù)評估了Siglec-9在慢性HBV感染者外周血NK細(xì)胞上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HBV感染者Siglec-9陽性的NK細(xì)胞頻數(shù)下降,，且與病毒復(fù)制呈負(fù)相關(guān),，此外，阻斷HBV感染患者NK細(xì)胞上的Siglec-9可增加NK細(xì)胞分泌IFN-γ,、TNF-α和CD107a脫顆粒能力,。雖然目前的研究證明Siglec-7/9參與了慢性HBV感染，但其對NK細(xì)胞功能的影響仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步闡明,。

2.6   LAG-3

LAG-3于1990年被發(fā)現(xiàn),，是一種Ⅰ型跨膜蛋白。LAG-3主要作用是抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖,，同時(shí)抑制Treg的功能,，LAG-3的結(jié)構(gòu)與CD4具有同源性，通過與CD4競爭性結(jié)合人白細(xì)胞抗原Ⅱ類來抑制T淋巴細(xì)胞功能^[50],。雖然LAG-3也在活化的NK細(xì)胞上表達(dá),，但其對NK細(xì)胞的調(diào)控作用尚未得到明確^[47]。Narayanan等^[51]用流式細(xì)胞術(shù)評估IFN-α對健康供體外周血NK細(xì)胞的影響,，發(fā)現(xiàn)暴露于IFN-α的NK細(xì)胞表面LAG-3的表達(dá)增加,，使用抗體體外抑制NK細(xì)胞上的LAG-3信號后，細(xì)胞因子IFN-γ,、TNF-α,、MIP-1α和MIP-1β的分泌顯著增加，但并不影響NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性,，因此他們認(rèn)為LAG-3可能是成熟NK細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子,，目前需要更多的研究來進(jìn)一步明確LAG-3對NK細(xì)胞的作用,。

在慢性HBV感染中，關(guān)于NK細(xì)胞的功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究結(jié)果仍然存在爭議,，Wang等^[52]認(rèn)為HBV的持續(xù)感染和導(dǎo)致肝損傷的原因可能是由于NK細(xì)胞的過度反應(yīng),，包括分泌的促炎細(xì)胞因子增多和細(xì)胞毒性增加，而免疫檢查點(diǎn)與其配體結(jié)合抑制NK細(xì)胞的功能則可作為保護(hù)慢性HBV感染者免受嚴(yán)重肝損傷治療的新靶點(diǎn),。因此,，需要進(jìn)行更多的研究來探索NK細(xì)胞功能在慢性HBV感染中的作用以及其功能失調(diào)的機(jī)制。

3小結(jié)與展望

為治療慢性HBV感染,，目前臨床上所使用的藥物主要為NA和IFN-α,。NA是阻斷DNA合成的直接抗病毒藥物，可有效降低HBV DNA,；IFN-α則通過多種機(jī)制產(chǎn)生抗病毒作用,，包括直接抑制受感染細(xì)胞中的RNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，并通過阻斷核衣殼的組裝來抑制HBV DNA復(fù)制,，還可以激活NK細(xì)胞和靶向HBV感染的T淋巴細(xì)胞,，因此，在極少部分患者中,，IFN-α治療可治愈感染,，但相比之下，NA僅能抑制HBV基因組復(fù)制,，對免疫反應(yīng)或cccDNA的持續(xù)存在影響很小,，并不能治愈感染^[53]。為完成世界衛(wèi)生組織提出的2030年前實(shí)現(xiàn)全球肝炎消除的目標(biāo),，許多研究者一直在探索治療CHB的新方案,，免疫治療也成為治療CHB探索的一個(gè)新方向。Envafolimab(ASC22)是一種皮下注射的針對PD-L1的單克隆抗體,，在我國，ASC22正在開發(fā)用于治療CHB和各種實(shí)體瘤^[54-55],。雖然目前慢性HBV感染者免疫功能調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未完全闡釋清楚,，但是伴隨著免疫檢查點(diǎn)在慢性HBV感染中的研究深入，將為臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持,，終將迎來更多能有效治療慢性HBV感染的藥物,。