 基于單細(xì)胞表觀基因組學(xué)表征順式調(diào)控元件幾個概念 順式調(diào)控元件[Cis-regulatoryelements (CREs)]: 調(diào)控同一染色體上的基因轉(zhuǎn)錄的非編碼DNA序列。它們包括增強(qiáng)子(enhancers),、啟動子(promoters),、絕緣子(insulators)、silencing elements和tethering elements,。不同的molecular marker組合可以鑒定不同類別的CREs,，包括染色質(zhì)可及性和表觀遺傳修飾等。 啟動子(Promoters):位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的CREs,。 增強(qiáng)子(Enhancers):可以從很遠(yuǎn)的基因組距離激活目標(biāo)基因表達(dá)的CREs,，該距離從幾千個堿基到數(shù)百萬個堿基對。這些元件位于靶基因啟動子的上游或下游,。 絕緣子(Insulators):位于增強(qiáng)子和啟動子之間,，阻止增強(qiáng)子激活靶基因的CREs。絕緣子也指可以防止異染色質(zhì)擴(kuò)散到常染色區(qū)域的邊界元素(boundary elements),。 Silencer elements: 位于靶基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近或較遠(yuǎn)的一種CREs,。Silencer elements與抑制性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以使基因表達(dá)失活。 Tethering elements: 將激活基因的啟動子和增強(qiáng)子系在一起的CREs,。 染色質(zhì)(Chromatin): DNA和組蛋白的復(fù)合物,。染色質(zhì)的基本單位是核小體。 組蛋白修飾(Histone modifications): 組蛋白上的共價修飾,，例如甲基化,、乙酰化,、磷酸化,、泛素化和蘇木酰化,，這些修飾發(fā)生在賴氨酸,、絲氨酸、蘇氨酸,、精氨酸和其他殘基上,。CREs的活性與這些修飾的writers,、erasers和readers的活性直接相關(guān)。 表觀基因組(Epigenome): 來自相同基因組序列的不同基因表達(dá)模式能夠穩(wěn)定傳播的組合特征(The combined features that enable stable propagation of different gene expression patterns from the same genome sequence),。包括胞嘧啶堿基的DNA甲基化(mC),、組蛋白的化學(xué)修飾、染色質(zhì)可及性和高級染色質(zhì)結(jié)構(gòu),。 3D染色質(zhì)組織(3D-chromatin organization): 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)纖維的折疊,，其決定了基因和CREs之間的空間接近度。雖然細(xì)胞類型復(fù)雜且多變,，但染色質(zhì)組織表現(xiàn)出某些共同特征,，包括A/B區(qū)室(A/B compartments)、拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域(topologically associating domains)和環(huán)(loops),。 人類基因組序列發(fā)布后不久,，就展開了在基因組中注釋CREs的工作；但很快就發(fā)現(xiàn),，僅靠序列信息不足以識別并描述CREs在每種細(xì)胞類型和發(fā)育階段的活性,。比如，啟動子和增強(qiáng)子通過與其他轉(zhuǎn)錄因子和/或染色質(zhì)相關(guān)的序列特異性轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,，以細(xì)胞類型特異性方式指導(dǎo)基因表達(dá)的時空模式來重塑復(fù)合物以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,。然而，這些相互作用也受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)節(jié),，比如染色質(zhì)可及性（可由DNase-seq/ATAC-seq獲知）,、DNA甲基化（可由WGBS獲知）和組蛋白修飾（可由ChIP-seq獲知）。啟動子和增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還取決于它們在細(xì)胞核內(nèi)的空間組織——真核細(xì)胞核中的染色質(zhì)纖維折疊形成TADs（可由CTCF-ChIP-seq獲知）,，其中的絕緣子促進(jìn)同一TAD內(nèi)的增強(qiáng)子和啟動子之間的相互作用,，并減少了不同TAD中的啟動子和增強(qiáng)子接觸。 Roadmap Epigenome Project及ENCODE已經(jīng)匯集了數(shù)百種組織樣本,、原代細(xì)胞或細(xì)胞系的表觀基因組數(shù)據(jù),，并注釋了數(shù)百萬個候選CREs（candidate CREs, cCREs）。盡管取得了這些進(jìn)步,，但現(xiàn)有的人類基因組cCREs目錄仍有不足——缺乏細(xì)胞類型分辨率,。雖然部分可以通過單細(xì)胞分析進(jìn)行解決，但只有大量存在且具有良好表征的表面標(biāo)志物的細(xì)胞類型（如血細(xì)胞）才能進(jìn)行足夠數(shù)量的分選/分離用以進(jìn)行后續(xù)分析,。更甚者,，稀有或未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型將不會被分析到，這就導(dǎo)致很難獲得完整的CREs,。 單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)（Single-cell epigenomic technologies）的發(fā)展提供了一種克服這些限制的方法——通過研究CREs的染色質(zhì)狀態(tài)變化與特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)之間的關(guān)系,，從而生成更全面的CREs目錄。 單細(xì)胞表觀基因組技術(shù)可以分為三種策略：1) Bulk檢測技術(shù)的小型化，即將單個細(xì)胞或細(xì)胞核分布到管或微孔中,，或?qū)⑵洳东@在微流控反應(yīng)室內(nèi),。每個細(xì)胞都用寡核苷酸形式的DNA條形碼標(biāo)記，然后將所有單細(xì)胞文庫匯合起來進(jìn)行測序,。這些方法的通量在幾百至幾千個細(xì)胞,，且每個細(xì)胞的成本相對較高；但這些方法所產(chǎn)生的文庫具有較高的覆蓋率,，非常適合分析有限細(xì)胞數(shù)目（如早期胚胎）的樣品。 2) 基于液滴的微流控平臺,，即通過微流控平臺的高流速實現(xiàn)一個細(xì)胞（或細(xì)胞核）與一個帶有DNA條形碼標(biāo)記的beads同時被捕獲于一個液滴中,。該方法的商業(yè)化使得其使用范圍最廣，且一個文庫能夠?qū)Χ噙_(dá)50,000個細(xì)胞進(jìn)行分析,。 3) 使用組合索引實現(xiàn)單細(xì)胞的高通量檢測,，即將細(xì)胞分配到微孔板中，每孔中含有一組細(xì)胞而不是單細(xì)胞,；同一孔中的細(xì)胞都有相同的DNA條形碼,；一輪索引結(jié)束后，所有孔的細(xì)胞被合并并重新分配到一組新的微孔板中,，以進(jìn)行另一輪索引,；最后通過索引的組合定義單細(xì)胞。該方法優(yōu)勢在于可以通過增加索引輪次或增加每輪索引的數(shù)量來提高通量,。與基于液滴的商業(yè)方法相比,，該方法的一個優(yōu)勢是其成本相對低廉。但該方法的實驗操作通常很復(fù)雜,，且所需的試劑（如Tn5酶）成本和批次差異很難保證,。  單細(xì)胞條形碼策略
近年來基于以上三種單細(xì)胞策略的方法層出不窮，初始版本是表征單一表觀基因組特征（如DNA甲基化,、染色質(zhì)可及性）的技術(shù),，最新的版本則是在同一細(xì)胞中并行分析多個表觀基因組特征和/或轉(zhuǎn)錄組。 表征單一表觀基因組特征的技術(shù)：  同一細(xì)胞中并行分析多個表觀基因組特征和/或轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)：  參考文獻(xiàn)：Preissl, S., Gaulton, K.J. & Ren, B. Characterizing cis-regulatory elements using single-cell epigenomics. Nat Rev Genet (2022). https:///10.1038/s41576-022-00509-1 |
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